Den zebrafisk är ett utmärkt experimentell organism att studera ryggradsdjur utvecklingsprocesser och modell mänsklig sjukdom. Här beskriver vi ett protokoll om hur man utför en manuell hög genomströmning kemisk skärmen i zebrafiskembryon med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) avläsning.
Zebrafisk har blivit en allmänt använd modellorganism för att undersöka de mekanismer som ligger bakom utvecklingsbiologi samt studera mänskliga sjukdomar patologi på grund av deras betydande grad av genetisk bevarande med människor. Kemisk genetik innebär testa effekten att små molekyler har en biologisk process, och har blivit en populär translationell forskning metod för att identifiera terapeutiska föreningar. Zebrafisk är speciellt tilltalande att använda för kemisk genetik på grund av deras förmåga att producera stora kopplingar av transparenta embryon, som utvändigt är befruktade. Vidare kan zebrafiskembryon enkelt vara drog behandlas genom den enkla tillsatsen av en förening till embryot medier. Att använda hela montera in situ hybridisering (WISH), kan mRNA-uttryck tydligt visualiseras inom zebrafiskembryon. Tillsammans, med hjälp av kemisk genetik och önskar blir zebrafisk en potent hel organism sammanhang som att bestämma den cellulära och fysiologiskaeffekter av små molekyler. Innovativa framsteg har gjorts i fråga om teknik som utnyttjar maskinbaserade procedurer, men för många laboratorier sådana alternativ inte är tillgängliga eller fortfarande kostsamt. Protokollet som beskrivs här förklarar hur man ska utföra en manuell hög genomströmning kemisk genetisk skärm som kräver grundläggande resurser och kan utföras av en enda individ eller en liten grupp på ett effektivt tidsperiod. Således ger detta protokoll en genomförbar strategi som kan genomföras av forskargrupper för att utföra kemisk genetik i zebrafisk, vilket kan vara användbart för att få grundläggande insikter i utvecklingsprocesser, sjukdomsmekanismer, samt att identifiera nya föreningar och signalvägar som har medicinskt relevanta tillämpningar .
Identifieringen av effektiva terapeutiska läkemedel för att behandla ohälsa är slutspelet för många biomedicinska forskare. Medan identifiering och karakterisering av potentiella farmakologiska medel för kliniska tillämpningar har uppenbara värde för sjukvården, har det varit en stor utmaning. Ytterst kommer utvecklingen av många terapeutiska ämnen från kunskap om hur specifika celltyper antingen utveckla eller funktion. Den zebrafisk, Danio rerio, är en sötvattens teleost av familjen Cyprinidae som har blivit en mainstream modellorganism i utvecklingsbiologi 1. Zebrafisk är genetiskt lätthanterliga ryggradsdjur som är lätta att underhålla och manipulera för vetenskapliga studier 2,3. Den zebrafisk embryot är transparent, externt befruktade, och kan produceras i hundratal från en enda vuxen parning par i bara en vecka 2,3. Dessutom zebrafisk aktie större organsystem och besitter en stor degree av genetisk likhet med däggdjur, inklusive människor 4. Påfallande, 70% av människans gener har en zebrafisk ortolog 4. På grund av denna likhet, har zebrafisk varit en mycket relevant experimentellt system för att studera mekanismerna för ryggradsdjur utveckling och fysiologi, och har använts för att sammanfatta en mängd mänskliga sjukdomar 5-7. Dessa skäl, bland andra, har gjort zebrafisk en idealisk kandidat för fortsatta genetiska förhör och har resulterat i ett stadigt ökande uppskattning för nyttan av zebrafisk i biomedicinsk forskning 6,7.
Under de senaste decennierna har ett överflöd av genetiska verktyg utvecklats i zebrafisk. Den zebrafisk genomet är mottaglig för mutagenes och transgenes 3. Hittills har en uppsjö av framåt och bakåt genetiska studier utförts, vilket leder till uppkomsten av över 9000 mutanter 3. Dessutom, många transgena linjer har varasv skapas, vilket har gjort det möjligt för märkning och isolering av specifika celltyper 3. Det har skett betydande pågående insatser för att centralisera och distribuera dessa resurser till forskarsamhället, som är tillgängliga för laboratorier på en relativt låg kostnad genom Zebrafish International Resource Center (Zirc) 8. Vidare har ett omfattande arkiv med biologisk information och molekylära verktyg, allt från genexpressionsmönster att morfolino sekvenser och protokoll, har successivt kommenterad på Zebrafish Information Network (ZFIN) 9-11. Dessa zebrafisk forskningsinfrastruktur har möjliggjorts genom betydande NIH stöd och förespråkande av denna djurmodell 8. Denna cache av zebrafisk mutanter, transgena linjer och relevant information fortsätter att vara ett exceptionellt värde för den biologiska forskarvärlden i allmänhet. Men medan zebrafisk är nu en väl etablerad och dominerande modellorganism, representerar de en largely outnyttjad reservoar för att studera utvecklingsbiologi och sjukdomar genom användning av kemiska genetiska skärmar.
Kemisk genetik är användningen av små molekyler, såsom läkemedel eller andra föreningar, för att påverka en biologisk process i ett levande system 12. Kemisk genetik kan genomföras för att förstå de molekylära mekanismer geners funktion, såsom att identifiera ämnen som räddnings- eller förvärra en specifik genetisk defekt 12. Vidare, kemisk genetik utgör en viktig väg att bedriva translationell forskning 12. Medan traditionella framåt genetiska skärmar i djurmodeller har varit oerhört kraftfull i att koppla specifika gener för sjukdomar, de saknar en tidsdimension, vilket gör det svårt eller ibland omöjligt att observera fenotyper som skulle uppstå efter tidig embryogenes. Dessutom kan gen redundans göra resultaten som observerats vid termins genetik svåra att tolka. Alternativt, kemiska genetiska skärmarmöjliggöra fin temporal kontroll och samtidigt ge en värdefull utgångspunkt för läkemedelsutveckling 12,13.
Kemisk genetik kan utföras med användning in vitro-system (t.ex., cellinjer, proteiner) eller med användning av ett in vivo-system, såsom en hel organism. Med användning av ett in vitro-system för kemisk genetik kan vara fördelaktigt eftersom det är enklare än en hel organism systemet, lättare att arbeta med i stor skala, mindre kostsam och mindre tidskrävande. Som ett resultat av in vitro-system tillåta både för high-throughput screening (HTS) och hög halt screening (HCS). Det finns ett antal fördelar med att använda ett in vitro-system som bör beaktas när man närmar kemisk genetik, men också betydande begränsningar. En stor begränsning med att använda en cellinje är att små molekyler kan vara effektiva och icke-toxiska i en specifik cellinje, och ändå bli giftiga när de införs i en hel organism. Således, den springande punktenav emissionen är att in vitro-system inte fånga den breda ramen för en organism och därför inte alltid möjlighet att exakt efterlikna vad som händer i en hel organism. Medan förening testning i hela organismer kan kringgå dessa frågor, användning av däggdjurs hela organismen modeller innebär ett antal fysiska och etiska begränsningar. Till exempel är drogscreening i musen logistisk hindras av det utrymme och kostnader som krävs för att testa ett adekvat antal prov. Dessutom kan utvecklingsmässiga frågor vara svåra att studera på grund av det faktum att däggdjur utvecklas i livmodern. Slutligen, medan genomförandet av den biomedicinska forskningen har stor samhällsnytta, finns det ändå stora behov för att skydda djurens välbefinnande genom att begränsa intensiva studier och lindra smärta och lidande för djur som används för forskning. Zebrafish ger en livskraftig substitut att arbeta med högre ryggradsdjur som däggdjur, och dessutom kan många ämnen studeras med kemisk genetik vidde embryonala och larvstadier när neurologisk behandling är frånvarande eller operativ på en låg nivå 12,13.
Hittills har en myriad av kemiska genetiska skärmar utförts med hjälp av zebrafisk embryon i synnerhet, eftersom förening leverans kan åstadkommas genom att sänka ner embryon i media innehållande drogen av intresse 12-15. Vidare har ett stort antal vetenskapliga och tekniska framsteg för att göra kemiska genetiska skärmar möjligt och hanterbart 16-20. Peterson och kollegor var de första att använda zebrafisk i en kemisk genetisk skärm under 2000, och senare under 2004 identifierat en förening som undertryckte en aorta coarctation mutation i zebrafisk 21,22. Kemiska skärmar har sedan genomförts för att studera flera utvecklings vävnader (t.ex., hjärta, blod, fartyg) 23-25, fysiologiska funktioner (t.ex. neurologisk grund för beteende) 26, vuxen regenere 27,28, och diseas e modeller (t.ex. muskeldystrofi och cancer) 29,30. Bland dessa zebrafisk kemiska skärmar, har upptäckten att prostaglandiner reglerar hematopoetiska stamceller förts till kliniska prövningar på människa, vilket visar kraften att gå från "tanken till säng" 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). På senare tid har lovande läkemedel uppstått för komplexa organ såsom njurarna, vilket sanera cellulär patologi i polycystisk njursjukdom (PKD) 34 och akut njurskada 27,35, även om dessa har ännu inte flytta till kliniska prövningar. Dessa kemiska genetiska skärmar visar i stort sett nyttan av att testa små föreningar i utvecklingszebrafisk och förmåga att tillämpa kemisk genetik att förhöra vuxen vävnad funktion. Dessutom finns det en växande lista av kommersiellt tillgängliga farmakologiska samlingar som är tillgängliga för akademiska studier 19.
ove_content "> Under de senaste åren har det funnits framstående framsteg inom kemisk genetisk screening teknik, inklusive användning av automatiserade system av robotar för läkemedelsdispensering och hantering, tillsammans med automatiska bildsystem 36-38. Sådana system medger möjlighet till testa tusentals av föreningar för att uppnå både HTS och HCS 36-38. Tyvärr, företaget av kemiska genetiska skärmar med dessa innovativa robotföretag kräver vanligen stora resurser. Dessa typer av resurser är ett betydande hinder för många institutioner som saknar kapital för att förvärva , driva och underhålla ett sådant instrument. Samtidigt som inrättandet av infrastruktur för robot hantering av kemiska bibliotek, inklusive överföring av embryon för att ställa i ordning tallrikar, förblir kostnads oöverkomliga för många laboratorier, automatiserad bildbehandling och analys är i allmänhet mer tillgänglig 12. Automatiserad bild screening möjliggör kvantifiering av fluorescerande transgen rebärare och underlättar specifik fenotypisk analys 12,15.Även automatiserade system utgör användbara tekniska framsteg, kan många frågor lösas genom mer fokuserade manuella skärmar, till exempel frågan om flera tusen biologiskt aktiva föreningar i en utvecklingsprocess med en hel-mount in situ hybridisering (WISH) avläsning 39. Vidare, medan allt fler laboratorier har åberopat zebrafisk kemiska skärmar för att undersöka en forskningsfråga, få (om någon) ansträngningar har nått mättnad och många ämnen har ännu inte brutit med hjälp av kemisk genetik. Kemiska skärmar kan utföras med hjälp av en liten zebrafisk koloni bestående av endast ett fåtal vildtyp eller transgena tankar. Därför bör denna form av genetisk förhör kunna uppnås av de flesta zebrafisk forskargrupper som är intresserade av att expandera / diversifiera in i denna arena. Kemiska bibliotek av varierande storlek kan tas tillvara från en kommersiell distributör och / eller collaborators. Av dessa skäl, kan kemisk genetik vara ekonomiskt genomförbart även i svåra finansieringsklimat. Men det finns hinder att börja en kemisk genetik skärmen, till exempel hur man planerar logistiska aspekterna av skärmen: t.ex. antalet personal som behövs för en lyckad skärm, Tilldelning av hängivna tid och sätter ihop en fysisk protokoll till manuellt processprover det nummer från hundratals till flera tusen. Här, vi detalj en manuell hög genomströmning protokoll för att utföra kemisk genetik i zebrafisk embryo med WISH som en utläsning. Denna metod innebär läkemedelsbehandling av zebrafiskembryon, följt av riboprob detektion av mRNA-transkript. Med hjälp av detta protokoll, en liten grupp eller en individ kan rimligen sålla och analysera en blygsam kemiskt bibliotek cirka 600 föreningar inom loppet av 9 veckor.
Kemisk genetik i zebrafisk kan göra en avgörande inverkan på utvecklingen av nya läkemedel. Detta protokoll ger en manuell hög genomströmning metod för att utföra kemisk genetik i zebrafiskembryon med WISH avläsning, effektivt att en enskild person eller en liten grupp att genomföra en liten molekyl skärmen. Denna minimala-resurs-metoden utökar möjligheten att kemisk genetik till många forskargrupper. Specifikt ger den här skärmen strategi ett viktigt alternativ till användningen av robot instrumentering, eftersom sådana system inte är brett tillgänglig över forskningsavdelningar. Denna handbok skärmen gör att en enskild individ att testa en 96 brunnar av föreningar med en WISH avläsning i en 6 dagars arbetsvecka. Sedan zebrafisk är oviparous, med embryona utvecklas utanför förälder, och embryona är stora nog att se med blotta ögat (mellan 1-3 mm), är de lämpade för manuell hantering med enkla instrument och forskaren kan array prover iflerbrunnsplattor utan användning av ett mikroskop. Vidare, eftersom zebrafisk utvecklas snabbt, kan små molekyler exponering vara effektivt med en enda behandling av en förening, i stället för upprepade doser, vilket minimerar ytterligare manuell hantering. Zebrafisk embryon är lätt odlas eftersom deras äggula ger en näringskälla upp till 5-6 dagar efter befruktningen, vilket eliminerar komplikation av yngel utfodring. Dessutom har de flesta av de larv organ utvecklas och bli funktionell under denna period, vilket ger möjlighet att studera ett brett spektrum av forskningsfrågor. Den enkla tillsatsen av små molekyler till embryot inkubationsmediet är icke-invasiv och tillåter forskaren (er) för att selektera för läkemedelsdosen, tid för tillsats, och varaktigheten av exponeringen-vilket ger god kontroll över många variabler och ge utrymme för specifika utvecklingsprocesser intressant som ska kontaktas. Som beskrivs här, kan betydande forskningsproduktivitet uppnås på kort timeframe att använda denna manual skärmen metodik. Enligt vår erfarenhet finns det en hög avkastning på det investerade ansträngning, vilket kan accentueras genom att använda en känd bioaktiva kemiskt bibliotek för att analysera en process av intresse, såsom nephron segmente under njur utveckling (Figur 4; Poureetezadi och Wingert, opublicerad).
Den manuella kemiska skärm som beskrivs här är exceptionellt mångsidig eftersom den inbegriper en analys på fasta zebrafisk prover. Till exempel kan denna strategi ses över för att testa flera plattor av föreningar i en vecka och sedan göra mål embryon följande vecka. Alternativa analyser på fasta zebrafisk prover, såsom immunohistokemi eller annan vävnad färgningsberedningar, kan också användas i stället för WISH utläsning. Experimentella strategier för att utföra cellulära analyser i zebrafisk kan anpassas på grund av optisk klarhet och insyn i tidiga utvecklingsstadier. Vidare kan forskare hämma pigmente vid senare staGES använda kemikalier eller undvika komplikation av pigment utveckling helt och hållet genom användning av pigment mindre genetiska rader som Casper eller ren zebrafisk 13. Det är möjligt att manuellt administrera små molekyler, bearbeta fläcken (er) av intresse, och för att manuellt göra mål embryon med hjälp av ett enkelt stereomikroskop. Emellertid är det viktigt att hålla i minnet att automatiserad bildanalys skulle kunna utföras, och kan i själva verket krävs för högupplöst fenotyp-analys. Exempelvis kan det vara föredraget att partnern ett automatiserat system för bildanalys med en direkt analys, såsom en transgen reporter, eftersom detta förenklar den manuella behandlingen av prover, kvantifierar skillnaderna inte lätt urskiljbara för blotta ögat, och eliminerar forskaren förspänna 15. Lyckligtvis vissa automatiserade bildsystem är både användarvänlig och ekonomiskt i termer av programvarukostnader 15. Användningen och kapacitet andra automatiserade system har snabbt utvecklats och kananvändas för inriktning av organismer, administrera läkemedelsbehandlingar, och till och med att flytta organismer 12,15. Dessa automatiserade system har inlett en ny teknologisk ålder forskning och har levererat innovativa lösningar för att manipulera stora mängder försökspersoner och på så sätt utföra HTS och HCS metoder i hela organismer 12,15. Även om sådana maskiner är onekligen användbara verktyg, de är också mycket kostsamma och är utom räckhåll för många grundläggande forskningslaboratorier. Utan tillgång till dessa automatiserade funktionerna kan det tyckas att kemiska skärmar är inte möjliga. Men detta protokoll beskriver en guide för hur man genomför en manuell skärm som kan användas för att fylla i en kemisk genetik skärmen på ett praktiskt sätt under en rimlig tidsperiod.
Nackdelar för både manuella screening och kemisk genetik i allmänhet finns, och bör hållas i åtanke när man överväger en kemisk skärmen. I synnerhet, metoden demonstreras här nödvändiggör en måttlig gradav fysisk skicklighet. Denna oro är minskad eller helt undviks genom repetition, eftersom fingerfärdighet kommer att förbättras med träning. Dessutom finns minimalt utrymme för grova fel, som det finns endast 10 embryon per brunn för analys. Små molekyler kan variera i penetrans av fenotypen som induceras, så en rimlig poäng regim för att identifiera föreningar av intresse måste följas. Det är viktigt att forskarna använder detta protokoll utforma lämpliga stränga kriterier för vad de kommer att överväga en träff. Det är också viktigt att komma ihåg att denna typ av form av skärmen troligen kommer att ge en viss del av falskt positiva, vilket kan avgränsade genom ytterligare kemisk upparbetning. Vidare är det viktigt att scenen embryon exakt och för att samla in kopplingar för screening strax efter befruktningen, som asynkron utveckling kan leda till komplikationer i noggrant utvärderar effekten av läkemedelsbehandlingar. Vidare, när det gäller kemisk screening som ett experimental strategi, det finns en mängd begränsningar. Föreningens löslighet och toxicitet av bärarmolekyler (t.ex., dimetylsulfoxid (DMSO)) kan också utgöras av ett problem och kan vara oöverkomlig i att testa många molekyler. Chorion kan också fungera som barriär mot läkemedelsexponering. Slutligen, även om zebrafisk är en kraftfull och translationell modell för kemisk genetik, man bör alltid tas vid bedömningen av om ett alternativt kemiskt skärmen strategi, t ex med hjälp av ett in vitro-system, såsom en cellinje, kan ersätta användningen av hela djur. Ändå är kemisk behandling i hela zebrafisk systemet anses bättre att genomföra liknande tillvägagångssätt i däggdjur, eftersom det ger fördelen att samla systemiska effekter av föreningarna och kan göra det möjligt för forskare att triage listan över föreningar som skall testas i en däggdjursmodell.
Hittills har zebrafisk kemiska skärmar ett kraftfullt experimentella verktyg to beskriva mekanismerna för utveckling och för att fastställa kandidat farmakologiska medel för användning inom medicinen, såsom identifiering av molekyler som kan förhindra sjukdoms patologier. Till exempel, en studie av Burns och kollegor utvecklat en automatiserad mikro bra test för hjärtfrekvensen med hjälp av transgena zebrafisk embryon som uttryckte GFP i myokardiet 42. De använde denna transgen linje att analysera pulsen i utvecklingen och hur den påverkades vid läkemedelsbehandling 42. En annan studie, genom att testa befolkningstäthet av hematopoetiska stamceller i zebrafisk embryot, identifierat att prostaglandin E2 reglerar HSC nisch 23. Detta fynd validerades i musen, och sedan implementerades för klinisk testning i humana navelsträngs transplantationer 23,31-33 (NIH, Clinical Trials.gov, NCT00890500; NCT01627314). Genom flera nya studier har kemisk genetik visat sig vara användbar för att studera njursjukdom hjälp av zebrafisk <supp> 43. Den zebrafisk njuren ger en utmärkt paradigm för att studera nephrogenesis eller regenerering av nefronet, den funktionella enhet som omfattar njuren under utveckling och akut njurskada 43. Nefronet struktur är mycket konserverad mellan zebrafisk embryonala njuren och den vuxna däggdjurs njuren 44-50. Flera studier undersöker zebrafisk embryonala njur illustrerar tydligt dess inneboende translationell potential när den kombineras med kemisk genetik. En kemisk genetik skärmen utfördes på två zebrafisk mutanter som mappats till gener pkd2 och ift172, vilka är kända för att vara viktiga aktörer i polycystisk njursjukdom (PKD) 34. Skärmen resulterade i att identifiera den pan-histondeacetylas (HDAC) inhibitor trichostatin A (TSA) som en liten molekyl som kan omintetgöra de morfologiska defekter som normalt sett i de muterade embryon. En annan strategi som de Groh och kollegor screenas för föreningar som Induced ödem i vildtyp zebrafisk embryon, vilket skulle tyda på en störning i njurfunktionen 35. Efter identifiering PTBA som en hit, konstaterade de att förutom att orsaka ödem, PTBA ökade också ett uttryck för pax2a, en markör för njur stamceller. Viktigt är en optimerad derivat av PTBA sedan visat sig minska den procentuella dödligheten för vuxna zebrafisk som genomgick gentamicin-inducerad njurskada och dessutom snabbare återhämtning av möss som drabbats av njurskador 27. Sammantaget ger dessa bidrag från zebrafisk kemisk genetik visa upp de typer av upptäckter som kan göras med hjälp av den metod som beskrivs i detta protokoll.
Medan kemisk genetik forskning bär betydande meriter, är det inte utan vissa problem. Enbart med hjälp av en kemisk genetik tillvägagångssätt kan göra det komplicerat att avgöra den specifika genen eller generna som påverkas av en förening. Även om ett mål (en) hittas, en significant gap kan kvarstå mellan förening identifiering och förstå mekanismen (s) handlings där lilla molekylen fungerar. Till exempel kan det vara svårt att bestämma den mekanism i vilken en liten molekyl agerar därför att en enda förening kan ha en rad olika effekter inom en organism. Men med tillkomsten av ny teknik och fler kemiska genetiska skärmar slutförs i zebrafisk, är problemet att om en mekanism krymper. En metod för att fastställa de molekylära effekterna av identifierade föreningar är att välja en läkemedels bibliotek av kända bioaktiva substanser för screening, där mekanismer kan eventuellt härledas från tidigare kommenterade uppgifterna. Dessutom chemoinformatic algoritmer, som Discovery gate, finns tillgängliga för användning som kan jämföra strukturella likheter mellan en förening mot en databas av föreningar med skrivs mekanismer 14. Ytterligare ett annat sätt att belysa mekanismen av en förening skulle vara att generera en MICRoarray profil efter behandling och sedan fråga den här profil på en sammanställning av microarray läkemedelsprofiler, såsom Connectivity Map, söker mekanistiskt definierade föreningar som framkallar en liknande effekt 14. Kan också användas för detta tillvägagångssätt för att identifiera genetiska mutanter som har en liknande effekt som föreningen av intresse. Att hitta en koppling mellan en förening och en mutant kan tyda på att föreningen fungerar molekylärt uppströms eller nedströms tillhörande genen, som kan avgränsas genom behandling av mutanter med föreningen och morpholinos. Ett annat alternativ skulle vara masspektrometri, som fortsätter att bli mer optimerad för zebrafisk. Denna metod kan användas för att beskriva specifika proteinförändringar eller posttranslationella modifieringar efter läkemedelsbehandling. Slutligen, små molekyler eller till och med hela bibliotek är ibland kunna taggade för pull-down av bindningspartners. Det är också värt att notera, att medan mekanismen för hur en liten molekyl fungerar is av betydande import, finns det FDA-godkända läkemedel för vilka mekanismerna är fortfarande okända.
Även om zebrafisk uppvisar många likheter med däggdjur, både genetiskt och fysiologiskt, finns det fortfarande en fråga om crossover drog 14. En studie undersökte crossover förmåga träffarna från en skärm för cellcykelinhibitorer i zebrafisk embryon 50. Skärmen resulterade i identifieringen av 14 träffar som tidigare var okända för att ha cellcykelaktivitet. Av dessa 14 föreningar har 6 visat sig ha cellcykelaktivitet i både mänskliga och zebrafisk cellodlingsanalyser, 3 visade sig vara serum inaktiv i cellodlingsanalyser, 1 var aktiv endast i zebrafisk celler och 4 hade någon aktivitet i antingen zebrafisk eller humana cellkulturanalyser, men bara i zebrafisk hela organismen. Noterbart är de 4 föreningar som endast haft verksamhet i zebrafisk visar att det finns skillnader mellan zebrafisk och däggdjur som kan prohibet translationell potential vissa föreningar. Detta är en viktig faktor att vara uppmärksam på, men det finns exempel på små molekyler, såsom PGE2 som förstärker förmågan hos HSCs att inympa i mänskliga mottagare och PTBA-derivat som förbättrar graden av njur återhämtning i däggdjur, vilket ger bevis av principen att crossover är möjlig 23,31-33.
Oavsett dessa fallgropar, kemisk genetik och denna minimala resurs tillvägagångssätt har mycket att erbjuda forskarsamhället. Kemisk genetik är särskilt användbar i zebrafisk och kommer att fortsätta att spela en avgörande roll för molekylär väg förhör och läkemedelsutveckling. Kemiska skärmar baserade på diskreta molekylära mål har historiskt varit föremål för en hög felfrekvens på grund av det som kallas konstellationen av adsorption, distribution, metabolism, utsöndring och toxikologiska (ADMET) egenskaper 51. Kemiska skärmar som utnyttjar zebrafisk tillinrikta sig på en process, snarare än en diskret mål, kan kringgå flera ADMET problem och identifiera föreningar som är effektiva i samband med hela organismen. Med den ökande pool av tillgängliga resurser för zebrafisk forskning, inklusive aktuella muterade stammar och förmågan att använda genomet redigering för att skapa riktade genetiska mutanter och transgena, det finns nästan ett obegränsat antal potentiella kemiska genetiska skärmar använder zebrafisk. Många kemiska bibliotek har kurator, och spänn samlingar med kända bioaktiva substanser, nya föreningar, strukturellt olika och strukturellt liknande. Dessa reagens ger en mängd spännande möjligheter för skärmkombinationer som finns idag och som sannolikt kommer att ytterligare öka under de kommande åren. Med dessa möjligheter i handen, ger denna handbok och hög genomströmning protokoll ett praktiskt och användarvänligt sätt att öka möjligheterna för forskargrupper att göra kemikalie genetiska skärmar använder zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av finansiering till Wingert forskningslaboratoriet från följande: National Institutes of Health bidrag K01 DK083512, DP2 OD008470 och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar beviljande av bidrag # 5-FY12-75; starta medel från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences; och en generös gåva till University of Notre Dame från Elizabeth och Michael Gallagher på uppdrag av Gallagher familj att främja stamcellsforskning. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar Paul T. Kroeger, Jr för att ge kritisk feedback på manuskriptet. Vi tackar personalen vid Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning vid Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg av våra zebrafisk koloni. Slutligen, vi tackar medlemmarna i vår research labb för sina kommentarer, diskussioner och insikter om detta arbete.
JoVE 51922 MATERIALS | |||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
0.1 – 10 υL natural pipet tips | USA Scientific | 1111-3800 | |
1 X E3 | N/A | N/A | Generate using 50X E3 and DI water. |
1 X Pbst | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in 1 X Pbs. |
10X Pbs | American Bioanalytical | AB11072 | |
12-well staining dish | BD-Falcon | 35-3225 | |
20X SSC | American Bioanalytical | AB13156 | |
24 well plate | BD-Falcon | 35-3226 | |
4% PFA/1X Pbs | N/A | N/A | Generate 4% PFA (w/v) in 1 X Pbs – boil then freeze and store at -20 °C. |
48 well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
50 X E3 | N/A | N/A | Generate 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4, 250mM NaCl, and 8.5mM KCl in DI water. |
96 deep well plate | VWR | 100-11-940 | |
96 well plate sealing mat | VWR | 10011-946 | |
anti-digoxigenin antibody | Roche | 11-093-274-910 | Keep at -20 °C. |
anti-fluorescein antibody | Roche | 11-426-338-910 | Keep at -20 °C. |
BCIP stock | Sigma | B8503 | Generate 50 mg/mL using 100% DMF – freeze then store at -20 °C. |
block solution | N/A | N/A | Generate 50 mL using 10 mL BSA (10%), 5 mL FCS, and 35 mL MABT. (Thaw BSA and FCS at 37 °C.) |
BSA (bovine serum albumin) stock | American Bioanalytical | AB00448 | Generate 10% BSA by stirring BSA flakes in MAB at room temperature then freeze and store at -20 °C. (Keep unused BSA flakes at 4 °C.) |
DIG/FLU labeled riboprobe in vitro transcription reaction reagents | Roche | 11175025910; 11685619910 | Consult the manufacturer procedure. |
DMF (dimethylformaldehyde) | American Bioanalytical | AB00450 | |
DNase 1 inhibitor, 10 X DNase 1buffer | Roche | 4716728001 | |
embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
epT.I.P.S 20-300 υL | Eppendorf | 22492284 | |
Ethanol (EtOH) | Sigma | E7023 | Generate 50mL of 70% EtOH with molecular grade H2O and 100% EtOH then store at -20 °C. |
FCS (fetal calf serum) stock | Invitrogen | 16140089 | Keep at -20 °C. |
filter sterilization unit | Corning | 430516 | 0.45 υm CA / 1L volume |
fine forceps | Roboz | RS-1050 | |
flat-bottom microcentrifuge tube | VWR | 87003-300; 87003-298 | |
Formamide | American Bioanalytical | AB00600 | Keep at -20 °C. |
glass basin 90 x 50 | Kimax Kimble | 23000 | |
glass pipette | VWR | 14673-010 | |
glass vial | Wheaton | 225012 | |
glycerol | Sigma | G7893 | |
glycine | Sigma | G8898 | |
glycogen | Roche | 10901393001 | |
HYB+ | Generate 50% formamide, 0.1% Tween-20, 5X SSC, 5 mg/mL yeast torula RNA, and 50 υL/υL heparin | ||
INT stock | Sigma | I8377 | Generate 55mg/mL using 70% DMF and 30% H2O – freeze then store at -20 °C. |
MAB | Generate by adding 55.0 g Trisma base, 8 mL of 1M Tric-HCl pH 9.5, 23.2 g maleic acid, and 17.5 g NaCl to 1.5 L of deionized H2O. Then fill with deionized H2O to 2L and autoclave. | ||
MABT | N/A | N/A | Generate 0.1% Tween-20 in MAB |
MeOH | Sigma | 34860-4L | |
mesh tea strainer | English Tea Store | SKU #ASTR_KEN, MPN#1705 | |
molecular grade distilled water | Mediatech | 25-055-CM | |
multi 8-channel pipette 0.5 – 10 υL | Eppendorf | 3122000.019 | |
multi 8-channel pipette 30 – 300 υL | Eppendorf | 3122000.051 | |
nanodrop | Thermo | ND-2000c | |
NBT stock | Sigma | N6876 | Generate 50mg/mL using 70% DMF and 20% H2O – freeze then store at -20 °C. |
paraformaldehyde | Electron Microscopy Services | 19210 | |
PCR-Film adhesive | Eppendorf | 30127.48 | |
plate container (Pencil Box) | Sterilite | 1722 | |
pre-staining buffer | N/A | N/A | Generate 01% Tween-20, 50 mM MgCl2, 100 mM NaCl, and 100 mM Tris pH 9.5. (Make fresh for use each time.) |
Pronase | Roche | 11459643001 | Generate 50mg/mL using E3, freeze then store at -20 °C. |
Proteinase K | Roche | 03-115-879-001 | Generate 10mg/mL in DI water then freeze and store at -20 °C. |
RNase 1 inhibitor | Roche | 3335399001 | |
rubber bulb | Fisherbrand Fisher Scientific | 03-448-22 | |
small plastic Petri dish | Corning | 430589, 430588 | |
SP6 RNA polymerase | Roche | 11487671001 | |
staining solution-purple | N/A | N/A | Generate using 45 υL of NBT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
staining solution-red | N/A | N/A | Generate using 31.5 υL of INT and 35 υL of BCIP for every 10 mL needed in pre-staining buffer. |
stereomicroscope | Nikon | SMZ645, SMZ1000 | |
T3 RNA polymerase | Roche | 11031171001 | |
T7 RNA polymerase | Roche | 10881775001 | |
transfer pipet | Samco | 202, 204 | |
Tween-20 stock | American Bioanalytical | AB02038 | |
waterbath | Thermo | 51221073 | (Model # 2831) |