Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Summary

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Abstract

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Introduction

Las células vivas banco de energía metabólica en forma de grasas e hidratos de carbono y el uso de esta energía para la biosíntesis, transporte de membrana y el movimiento. Parte de la energía se obtiene en el citosol a través de la conversión de los azúcares de la dieta directamente en ATP durante la glucólisis. Sin embargo, la principal fuente de producción de ATP en una célula es aprovechada dentro de la mitocondria a través de la cadena respiratoria mitocondrial ^1. La arquitectura de las mitocondrias proporciona la orientación espacial necesaria para la producción de ATP eficaz y eficiente. Las mitocondrias poseen una doble membrana separadas por un espacio intermembrana y junto con la matriz, el compartimento mitocondrial más interior, la casa de los componentes y coordinar las reacciones químicas implicadas en la generación de ATP. La membrana interna contiene una serie de complejos de proteínas unidas a la membrana que comprenden la cadena respiratoria así como la ATP sintasa, el complejo de proteína que trae ADP y Pi juntos para la formación de ATP. La posadamembrana del ER se dobla en crestas y los electrones se pasan a lo largo de los complejos de la cadena respiratoria por medio del citocromo c, un portador de electrones soluble que se mueve entre los complejos dentro del espacio intermembrana. Como los electrones se mueven, la oxidación de equivalentes reductores se produce y los iones de hidrógeno se bombea desde la matriz al espacio intermembrana. Como consecuencia de la alta concentración de iones dentro del espacio intermembrana, un gradiente electroquímico construye lo que resulta en un potencial de membrana a través de la membrana mitocondrial interna (Δψ) ^2. El oxígeno es el aceptor final de electrones de la cadena de transporte de electrones y iones de hidrógeno fluya a través de las ATP sintasas desde el espacio intermembrana de nuevo a la matriz, y al hacerlo directamente causar la formación de ATP. Este proceso tal como se describe en su totalidad se conoce como la fosforilación oxidativa. Los pliegues de las crestas aumentan el área de superficie de la membrana interna, lo que permite el transporte de electrones máxima y la producción de ATP dentro decada mitocondria. Las proteínas, enzimas y otras moléculas implicadas en la fosforilación oxidativa se derivan de ambos genes nucleares y mitocondriales. Las mitocondrias contienen su propio ADN circular, que codifica para 13 proteínas así como ARNt y ARNm necesarias para la producción de ATP ^3. Sin embargo, se requieren muchas más proteínas y por lo tanto son nuclear codificada. La mayoría de estas proteínas codificadas en el núcleo están dirigidos a la matriz mitocondrial mediante el uso de presecuencias en el extremo N-terminal de la proteína precursora, y su importación es impulsado en parte por Δψ ^4,5.

Más allá de contribuir a la bioenergética de una célula, las mitocondrias también influyen en importantes procesos metabólicos tales como TCA y beta-oxidación, la señalización celular a través de la regulación de calcio, así como un papel clave en la apoptosis ^6. En concreto, durante los momentos de estrés celular, las proteínas Bcl-2 la familia que residen en o interactúan en la membrana externa mitocondrial puede causar mitocondrialpermeabilidad de la membrana exterior (MOMP) ^7,8. Durante MOMP, el citocromo c y otras proteínas se liberan en el citosol, y junto con varias proteínas citosólicas forman un complejo llamado el apoptosome ^9,10. El apoptosome activa las caspasas que van a escindir las proteínas celulares y el ADN durante la fase de ejecución de la apoptosis. Tan pronto como se produce MOMP, ΔΨ se derrumbó y la producción de ATP se detuvo. Por lo tanto la función mitocondrial, como apoptosis se inicia se ve comprometida y los cambios en ΔΨ puede ser correlacionada con la salud mitocondrial y celular ^12. Mientras que la apoptosis es un punto final en muchos modelos de la enfermedad, la función mitocondrial y cambios a ΔΨ también puede proporcionar información valiosa acerca de originación y / o progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los cambios estructurales y funcionales mitocondriales se han documentado durante el curso de enfermedades neurodegenerativas ^13,14.

En la primera parte del protocolo, isomento de las mitocondrias intactas que conservan su ΔΨ se describe. Células HEK-293T fueron expuestas a diferentes concentraciones y combinaciones de TNF-α recombinante, IL1-β e IFN-γ para inducir apoptosis. Estas citoquinas fueron elegidos porque son frecuentes a ser alta en muestras sépticos humanos primarios ¹⁵ y la vía extrínseca de la apoptosis puede ser desencadenada por la interacción de unión a su receptor TNF-α ^6. Puesto que hay variaciones sutiles necesarias para aislar las mitocondrias funcional a partir de tejidos primarios en comparación con células cultivadas, y porque mucha investigación utiliza animales, el protocolo también describe cómo aislar las mitocondrias a partir de hígado y médula espinal de antero esclerosis lateral (ALS) modelo de ratón.

La segunda parte del protocolo fue desarrollado para monitorear a las perturbaciones del potencial de membrana mitocondrial usando un colorante fluorescente sensible al potencial con un lector de placa fluorescente. Diferencias entre el estado celular (es decir, sanos vs. poco saludable) se diferencian por la cuantificación de la fuerza de ΔΨ de mitocondrias aisladas en conjunción con agentes de desacoplamiento, inhibidores de la cadena respiratoria, inhibidores de complejos y ionóforos, todos los cuales causan la disipación del potencial de membrana mitocondrial. El saludable las mitocondrias, mayor es el cambio en ΔΨ tras el tratamiento con inhibidores mitocondriales, por lo tanto, la respuesta de las mitocondrias se puede utilizar como un indicador de la función mitocondrial (dys).

El uso de mitocondrias aisladas en lugar de en la evaluación in situ de función ofrece evidencia definitiva de que una patología o tratamiento modula directamente los cambios en el orgánulo ^16-18. Si bien existen métodos en la literatura para aislar las mitocondrias a partir de células cultivadas, que son vagos ¹⁷ y / o utilizan equipo especializado ^16. Este protocolo describe en detalle el método de aislamiento y esfácilmente adaptable a otras líneas celulares, incluyendo el tejido primario y culturas ^13,14,19,20. Muchos estudios mitocondrias aisladas utilizan los mismos desacopladores e inhibidores mitocondriales utilizados en este protocolo, pero con un electrodo de Clark ^{(figura 21} es un ejemplo representativo de muchos trabajos en la literatura), que a su vez es una pieza muy específica y especializada de los equipos. Además, este método tradicional tiene limitaciones tales como un bajo rendimiento y alta complejidad ^22,23 y requiere una cantidad sustancial de las mitocondrias (~ 500 g / reacción). En este protocolo, el fluorescente potencial de membrana TMRE sonda de detección se utiliza en conjunción con un lector de placas fluorescente, que es una máquina estándar en muchos laboratorios. TMRE es ampliamente considerado ya que rápidamente entra en las células y las mitocondrias aisladas y se puede utilizar en concentraciones bajas ^24. Múltiples reacciones rápidamente se pueden configurar en tándem y lotes analizados mediante este protocolo. Además, la reacción des requieren una pequeña cantidad mucho de las mitocondrias aisladas (~ 10 g / reacción). Al requerir menos material, muestras de tejido o cultivo de células más pequeñas se pueden utilizar como punto de partida para el aislamiento de las mitocondrias, más repeticiones o reacciones se pueden configurar, y material potencialmente suficiente para otros experimentos mitocondrias aisladas, tales como la producción de ATP, el consumo de oxígeno, o la importación ensayos son posibles.

Protocol

Todos los experimentos con animales se ajustaban a los Institutos Nacionales de Salud y fueron aprobados por la Universidad de Wake Forest Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Las parejas reproductoras para SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] modelo de ratón se obtuvieron de El Laboratorio Jackson (Bar Harbor, ME). De tipo salvaje (WT) hembras y machos SOD1G93A no transgénicos [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] fueron criados para generar ratones SOD1G93A y WT littermates no transgénicos que fueron utilizados en lo…

Representative Results

El tratamiento de células HEK-293T con 200 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, y 75 ng / ml de IFN-γ (* 3) durante 24-48 hr conduce a cantidades progresivas de la muerte celular (Figura 1A ). La viabilidad celular se evaluó mediante ensayos de MTT y consistentemente demuestra que no es de ~ 10% de disminución en la viabilidad celular con el tratamiento 24 hr y ~ disminución del 20% con el tratamiento 48 hr. Las células tratadas con concentraciones similares (100 pg / ml de TNF-α, 40 ng / ml IL1…

Discussion

El tratamiento de células HEK-293T con citoquinas recombinantes hace que cantidades moderadas de la muerte celular durante 48 hr (Figura 1). La cantidad de muerte celular inducida por el tratamiento TNF-alfa es similar a los estudios reportados previamente ³⁰ y la viabilidad celular disminuye después de la co-administración de múltiples citoquinas que son mayores que las cantidades acumulativas con cualquier citoquina sola también es coherente con la literatura ^31,32. La capac…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
L-glutamic acid	Sigma	G1251	Can use the potassium salt instead.
malic acid	Sigma	M8304	Can use the potassium salt instead.
KH2PO4	Sigma	P0662
K2HPO4	Sigma	P3786
EGTA	Sigma	E3889
Trisma base	Sigma	T6066
MOPS	Sigma	M3183
CCCP	Sigma	C2920	Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.
Valinomycin	Sigma	V0627	Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.
sucrose	Fisher	S5-500
KCN	Mallinckrodt	6379	Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water
rotenone	Sigma	R8875	Highly toxic. Made in ethanol.
oligomycin	Sigma	O4876	Highly toxic. Made in ethanol.
ADP	Sigma	A2754
TMRE	Sigma	8717-25mg	Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.
DMEM	Gibco	11965-084	1x regular (high glucose).
Pen/Strep	Invitrogen	15140-155
L-glutamine	Fisher	SH3002101	Store aliquots at -20C
FBS	Lonza	14-501F	US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20
Trypsin-EDTA	Sigma	T4049
DMSO	SIgma	D2650
Protien Assay Dye (5x)	Bio-Rad	500-0006	Any protein assay can substitute.
BSA	Fisher	BP1600-100	Make 2mg/mL stock in water for protein assay.
MTT powder	Sigma	M2128	Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.
Tergitol solution (NP-40)	Sigma	NP40S
Recombinant Human IL-1B	Gibco	PCH08014	Once opened store aliquots at -20C
Recombinant Human TNF-alpha	Gibco	PHC3015L
Recombinant Human IFN-gamma	Gibco	PHC4031
Dulbeccos PBS (-/-)	Sigma	D8537	Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.
Cytochrom c ELISA kit	R&D systems	DTC0	Human for HEK-293T cells.