Visualisere Ikke-lytiske exocytose af<em> Cryptococcus neoformans</em> Fra Makrofager hjælp af digitale lysmikroskopi

Summary

Vi beskriver, hvordan man kan visualisere macrophage- C. neoformans (cn) interaktioner i realtid, med særlig vægt på processen ikke-lytisk exocytose hjælp af digital lysmikroskopi. Brug af denne teknik individuelt inficerede makrofager kan undersøges for at fastslå forskellige aspekter af dette fænomen.

Abstract

Mange aspekter af infektion af makrofager af Cryptococcus neoformans er blevet grundigt undersøgt og veldefineret. Men en særlig interaktion, der ikke er klart forstået er non-lytisk exocytose. I denne proces er gærceller frigives i det ekstracellulære rum ved en dårligt forstået mekanisme, der lader både makrofager og Cn levedygtige. Her beskriver vi, hvordan at følge et stort antal individuelt inficerede makrofager til en 24 timers infektion periode ved tidsforkortet mikroskopi. Inficerede makrofager er opstaldet i et varmekammer med en _{CO2-atmosfære} fastgjort til et mikroskop, der giver de samme betingelser som en celle-kultur kuvøse. Levende digital mikroskopi kan give oplysninger om den dynamiske interaktion mellem vært og patogen, der ikke er tilgængelig fra statiske billeder. At være i stand til at visualisere hver inficeret celle kan give et fingerpeg om, hvordan makrofager håndtere svampeinfektioner, og omvendt. Denne teknik ISA kraftfuldt værktøj i at studere den dynamik, der ligger bag et komplekst fænomen.

Introduction

De faser af en svampeinfektion mellem kryptokok celler og makrofager er veldokumenterede ^1-3. Efter gærceller indtages af makrofager, kan en række interaktioner forekomme: makrofag kan lysere frigiver sin fungal belastning i det ekstracellulære rum, eller det kan kontrollere infektionen ved at holde gærcellerne inden for rammerne af dens cellulære membran ^4. Men for flere år siden en ny resultat blev beskrevet uafhængigt af to grupper: ikke-lytisk exocytose, en proces, hvor en makrofag slettet nogle af eller alle de kryptokok celler i det omgivende miljø eller en nabocelle og både vært og patogen forblive rentable ^{5 -8.} Flere undersøgelser har forsøgt at forstå de molekylære mekanismer bag denne interaktion, men vi har stadig ikke en fuld forståelse af, hvad der driver dette fænomen.

Evnen til at fange billeder i realtid og efterfølgende analysere flere inficereed makrofager tillader en at besvare mange spørgsmål om de fysiske egenskaber omkring ikke-lytisk exocytose i forhold til timing, fysisk kapacitet, ændringer i morfologi og endda stress af makrofager i løbet af en svampeinfektion. Ved at tillade cellerne, der skal anbringes i et miljø, der er sammenlignelig med en inkubator, kan vi glimt den dynamiske karakter af makrofag-fungal celle interaktioner. Forskere har anvendt denne teknik til at undersøge forskellige komponenter i denne proces. Rolle fagosomet i denne proces blev gjort synlige med fluorescerende farvning og actin blokerende midler ^9, mens en anden gruppe brugt denne metode til at vise, at ikke-lytisk exocytose blev blokeret i celler, der har haft WASH kernedannende proteindomæner slettet ^10. Virkningen af cytokin signalering er også blevet konstateret ved hjælp af real-tid mikroskopi ^11. Denne proces er ikke begrænset til C. neoformans som det er også blevet observeret med Candida albicans, another fungale patogen, der har evnen til at inficere makrofager ^12. Disse resultater er eksempler på, hvordan denne metode kan give et væld af oplysninger til et område, vi ved så lidt om.

Protocol

Alle dyr blev arbejdet i overensstemmelse med reglerne og retningslinjerne for Institute for Animal Studies på Albert Einstein College of Medicine. 1. Vækst Betingelser C. neoformans H99 (serotype A) Grow individuel C. neoformans (cn) kolonier på Sabouraud agarplader. En dag før eksperimentet, skal du vælge en koloni og pode 10 ml Sabouraud bouillon. Tillad kulturen at vokse natten over ved 37 ° C under omrystning ved en hastighed på 25…

Representative Results

De billeder, at denne teknik producerer kan analyseres i en række forskellige måder at indsamle information omkring hvad der sker efter cellerne er fagocyteret C. neoformans. Som det ses i figur 1, er der cirka 100 makrofager, som er enten inficerede eller ikke-inficerede. Hver af disse makrofager giver seeren mulighed for at studere værtspatogene interaktioner på en meget mikroskopisk niveau. Som figurerne 2 og 3 viser, er der forskellige resultater, der k…

Discussion

Her har vi beskrevet en fremgangsmåde, ved hvilken svampe-makrofag interaktioner kan registreres og analyseres i realtid over en 24 timers periode. Vores laboratorium har anvendt denne protokol til at studere mange af de tidsmæssige aspekter af ikke-lytisk exocytose og vil fortsætte med at bruge realtid mikroskopi at fastslå de morfologiske elementer, der omgiver denne proces.

Til denne teknik til at give ideelle resultater, bør man være særlig opmærksom på visse trin i protokollen….

Materials

Sabouraud Dextrose Agar	BD	DF0109-17-1
Sabouraud Dextrose Broth	BD	DF0382-17-9
Dubelcco's Modified Eagle's Medium(DMEM)	Corning Cellgro	10-013-CV
Fetal Calf Serum ( FCS)	Atlanta Biologicals	S12450
NCTC 109	Invitrogen	21340-039
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
HEPES Buffer	Corning Cellgro	25-060-Cl
Glutamax	Invitrogen	35050-061
Non-essential Amino Acids	Corning Cellgro	25-025-Cl
2-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985-023	Toxic
3003 Tissue Culture Petri Dishes	Fisher Scientific	08772E
CellStripper	Corning Cellgro	25-056-Cl
Mat-tek Glass Bottom Culture Dishes	MatTek	P35GC-1.5-14-C
LPS	Sigma	L3137
Mouse IFN-g	Roche	NC 9222016
mAb 18B7	Non-commerical antibody produced in our lab
Axiovert 200M Microscope with Incubating Chamber	Zeiss