בידוד, Cryopreservation ותרבות של תאי אפיתל amnion אדם ליישומים קליניים
Summary
We describe a protocol to isolate and culture human amnion epithelial cells (hAECs) using animal product-free reagents in accordance with current good manufacturing practices (cGMP) guidelines.
Abstract
Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a potential source of cells for regenerative medicine. The reason for this interest is evidence that these cells have highly multipotent differentiation ability, low immunogenicity, and anti-inflammatory functions. These properties have prompted researchers to investigate the potential of hAECs to be used to treat a variety of diseases and disorders in pre-clinical animal studies with much success.
hAECs have found widespread application for the treatment of a range of diseases and disorders. Potential clinical applications of hAECs include the treatment of stroke, multiple sclerosis, liver disease, diabetes and chronic and acute lung diseases. Progressing from pre-clinical animal studies into clinical trials requires a higher standard of quality control and safety for cell therapy products. For safety and quality control considerations, it is preferred that cell isolation protocols use animal product-free reagents.
We have developed protocols to allow researchers to isolate, cryopreserve and culture hAECs using animal product-free reagents. The advantage of this method is that these cells can be isolated, characterized, cryopreserved and cultured without the risk of delivering potentially harmful animal pathogens to humans, while maintaining suitable cell yields, viabilities and growth potential. For researchers moving from pre-clinical animal studies to clinical trials, these methodologies will greatly accelerate regulatory approval, decrease risks and improve the quality of their therapeutic cell population.
Introduction
תאים המופקים ממקורות סביב הלידה, כגון השליה, שליה קרומים, חבל טבור ומי שפיר שמשכו את תשומת לב של חוקרים וקלינאים כמקור פוטנציאלי של תאים לרפואת רגנרטיבית 1,2. הסיבה לעניין זה היא כי סוגים אלה תא כל יש מידה מסוימת של גמישות ויכולת המערכת החיסונית 3, תכונות שהן יסוד ליישומים הטיפוליים הפוטנציאל שלהם.
hAECs היא אוכלוסייה הטרוגנית אפיתל שניתן להפיק מקרום amnion טווח או מראש טווח 4, מתן מקור פוטנציאלי בשפע של חומר תאי משובי. התכונות שהופכות את hAECs מושך כטיפול תאי כוללות multipotency שלהם, immunogenicity הנמוך, ותכונות אנטי דלקתיות. hAECs כבר מצא להיות multipotent ביותר הן במבחנה in vivo, מסוגלים להבדיל לשושלות mesodermal (cardiomyocytes, myocytes, osteocytes, adipocytes), שושלות endodermal (תאי לבלב, תאים כבד, תאי ריאה) ושושלות ectodermal (שיער, עור, תאים עצביים והאסטרוציטים) 5-10.
מרגיע, למרות hAECs multipotency שלהם אינו מופיע לשני גידולי טופס או לקדם התפתחות גידול in vivo. יתר על כן, hAECs גם חיסון חסוי, המבטא רמות נמוכות של II אנטיגנים המעמד אנושיים לויקוציטים (HLAs) 8. נכס זה צפוי עומד בבסיס היכולת שלהם כדי להתחמק מדחייה חיסונית לאחר השתלה אלוגנאית וxenogenic, כפי שהודגם במחקרים בקופים חיסוניים מוסמכים, ארנבות, שרקנים, חולדות, וחזירים 11-13. hAECs להציג המערכת החיסונית חזקה ונכסים לדיכוי המערכת החיסונית ובכך להציע יתרונות מעשיים משמעותיים עבור יישומים קליניים פוטנציאליים בטיפול מחלה אוטואימונית. הם האמינו hAECs להפעיל פונקציות המערכת החיסונית בשתי מערכות החיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. בדואר של המנגנונים הציעו, הוא באמצעות ההפרשה של המערכת החיסונית גורמי 14.
יישומים הנוכחיים של hAECs במודלים של בעלי החיים מחלה פרה-קליניים כוללים טיפול בשבץ מוחי, טרשת נפוצה, מחלת כבד, סוכרת ומחלות ריאה כרוניות ואקוטיות. חוקרים הראו עניין בשימוש hAECs לטיפול בדלקת מוח שבץ-פוסט בשל המאפיינים הייחודיים שלהם. יש ראיות לכך hAECs יכול לחצות את מחסום דם המוח שבו הם יכולים נקלטים, לשרוד עד 60 יום, להתמיין לתאי עצב, להקטין את הדלקת ולקדם את ההתחדשות של רקמות פגועות של מערכת עצבים מרכזיות במודלים של בעלי חיים של מחלות נוירולוגיות 15.
hAECs מציע את היכולת לכוון ולהפוך מסלולי פתולוגי מרובים שתורמים להתפתחות וההתקדמות של טרשת נפוצה. לדוגמא, נובע ממחקרים בבעלי חיים פרה-קליניים מציע כי hAECs הם מאוד מדכא את מערכת חיסון ועלול לגרום לסובלנות חיסונית פריפריה ולהפוך תגובות דלקתיות מתמשכות. hAECs גם הוכח יש את היכולת להתמיין לתאים עצביים in vivo ולשפר neuroregeneration אנדוגני באמצעות ההפרשה של מגוון רחב של גורמי neurotrophic 16.
תאי אפיתל אדם וamnion המכרסם כבר הוכיחו היעילות הטיפולית שלהם לטיפול במחלות כבד במודלים של בעלי חיים. במודל פחמן טטרא אינדוקציה נזק של מחלת כבד, השתלה להוביל hAEC לengraftment של hAECs קיימא בכבד, מלווה באפופטוזיס hepatocyte מופחת, וירידה בדלקת ופיברוזיס 17 בכבד.
יכול להיות מגורה hAECs לגורמי לבלב הביעו כוללים מובילי אינסולין וגלוקוז. מספר מחקרים בחנו את הפוטנציאל לhAECs לשחזר את רמות הגלוקוז בדם בעכברים סוכרתיים 18. בעכברים שקבלhAECs, שתי רמות הסוכר בדם ומשקל הגוף של בעלי החיים ירד לרמות נורמליות לאחר הזרקה של תאים. מחקרים אלה מציגים טיעון חזק לשימוש בhAECs לטיפול בסוכרת.
יש לי hAECs תפקיד מוכח במניעה ובתיקון של פגיעת ריאות חריפה וכרונית ניסיונית בשני מבוגרים ודגמי יילודי 19. מחקרים אלה מצאו כי hAECs להבחין במבחנה לתאי האפיתל ריאות פונקציונליות להביע חלבונים הקשורים ריאה מרובים, כוללים סיסטיק פיברוזיס הטרנסממברני מוליכות רגולטור (CFTR), ערוץ היון שעובר מוטציה בחולים עם סיסטיק פיברוזיס 20. בנוסף, כאשר hAECs מועברים למבוגר הפצועה וריאות של ילוד, שהם מפעילים השפעות המתקן שלהם באמצעות האפנון של תאים חיסוניים מארח, צמצום גיוס לויקוציטים ריאה, כוללים נויטרופילים, מקרופאגים ולימפוציטים מסוג 21-23.
בהתחשב בשפע שלהם,שיא בטיחות, ויישומים קליניים מוכחים למחלות מרובות, ניסויים קליניים באמצעות hAECs הוא בלתי נמנע. במטרה להאיץ את התרגום של טיפולי hAEC לקליניים-ניסויים, שפיתחנו שיטות לבודד, cryopreserve וhAECs התרבות באופן מתאים לניסויים קליניים, באמצעות ריאגנטים ללא מוצר מן החי בהתאם לשיטות ייצור טובות הנוכחיות הנחיות (cGMP) .
פרוטוקול זה אנו מבוססים פרוטוקול שפורסם בעבר שאנחנו משתמשים בהצלחה לבודד hAECs באמצעות ריאגנטים מן החי 6. אנחנו שיניתי את הפרוטוקול המקורי כדי להחליף מוצרים המופקים מבעלי חיים עם ריאגנטים ללא מוצר מן החי, ואופטימיזציה שלאחר מכן בוצעה כדי לייעל את תשואת תא, כדאיות וטוהר. המטרה שלנו הייתה לפתח פרוטוקול שעומד בתקנים רגולטוריים לתא ייצור לניסויים קליניים בבני אדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר פרמטרים קריטיים שיכול להשפיע באופן משמעותי בהצלחתה של מתודולוגיה זו. אחסון של השליה או amnion עד 3 שעות לפני הבידוד של hAECs עשוי להיות רצוי למטרות לוגיסטיים או תזמון, אולם מומלץ שרקמת מעובד בהקדם האפשרי. אם רקמה היא להיות מאוחסנת, מומלץ כי אחסון להתבצע הבא לנתיחה…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge financial support from the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Collection Kit | |||
| Stripping tray | Fisher Scientific | 13-361B | |
| Liberty Dressing Forcep, pointed 13cm | Fisher Scientific | S17329 | |
| Scissors – Sharp/Blunt Straight | Fisher Scientific | NC0562592 | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| Protective Apparel (Gown) | U-line | S-15374-M | |
| Protective Apparel | |||
| Isolation gowns | U-line | S-15374-M | |
| Sterile latex gloves | Fisher Scientific | 19-014-643 | |
| General purpose face mask | Cardinal Health | AT7511 | |
| Bonnets | Medline | CRI1001 | |
| Shoe covers | U-line | S-7873W | |
| Media and Reagents | |||
| Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175095 | without calcium or magnesium |
| TrypZean(animal product–free recombinant trypsin) | Sigma Aldrich | T3449 | |
| Soybean Trypsin Inhibitor 1g/50mL | Sigma Aldrich | T6522 | |
| Cryostor CS5 | BioLife Solutions | 205102 | |
| Trypan blue reagent | Life Technologies | 15250-061 | |
| anti-EpCam-PE | Miltenyi Biotec | 130 – 091-253 | |
| PE-isotype control | Miltenyi Biotec | 130-098-845 | |
| anti-CD90-PeCy5 | BD Pharmingen | 555597 | |
| PeCy5-isotype control | BD Pharmingen | 557224 | |
| anti-CD105-APC | BD Pharmingen | 562408 | |
| APC-isotype control | BD Pharmingen | 340754 | |
| Collagen Type VI | Sigma Aldrich | C7521 | |
| Consumables | |||
| 50mL graduated pipette | BD/Falcon | 356550 | |
| 10mL graduated pipette | BD/Falcon | 356551 | |
| 5mL graduated pipette | BD/Falcon | 356543 | |
| 50mL falcon tubes | BD/Falcon | 352070 | |
| 15mL falcon tubes | BD/Falcon | 352096 | |
| 15-cm petri dishes | Corning | 351058 | |
| 70-μm filters | BD/Falcon | 352350 | |
| 0.22-μm filters | Millipore | SLGV033RS | |
| 1ml Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-401 | |
| 200ul Pipette tips | Fisherbrand | 02-707-409 | |
| 20ml Syringe | BD/Medical | 309661 | |
| Plastic spatula | Fisher Scientific | 14-245-97 | |
| Plastic weighing boat | Fisher Scientific | 02-202-102 | |
| Cryo vials | Nunc | 377267 | |
| Equipment | |||
| Mr Frosty | Fisher Scientific | A451-4 | |
| Biohazard Cabinet |
Riferimenti
- Murphy, S. V., Wallace, E. M., Jenkin, G., Appasani, K. . Stem Cells and Regenerative Medicine. 1, 243-264 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. Amniotic fluid and placental membranes: unexpected sources of highly multipotent cells. Semin. Reprod. Med. 31 (1), 62-68 (2013).
- Parolini, O., et al. Concise review: isolation and characterization of cells from human term placenta: outcome of the first international Workshop on Placenta Derived Stem Cells. Stem Cells. 26 (2), 300-311 (2008).
- Lim, R., et al. Preterm human amnion epithelial cells have limited reparative potential. Placenta. 34 (6), 486-492 (2013).
- Tamagawa, T., Ishiwata, I., Saito, S. Establishment and characterization of a pluripotent stem cell line derived from human amniotic membranes and initiation of germ layers in vitro. Hum Cell. 17 (3), 125-130 (2004).
- Miki, T., Marongiu, F., Ellis, E., Strom, C. S. Isolation of amniotic epithelial stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.3 (2007).
- Murphy, S., et al. Amnion epithelial cell isolation and characterization for clinical use. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, Unit 1E.6 (2010).
- Ilancheran, S., et al. Stem cells derived from human fetal membranes display multilineage differentiation potential. Biol Reprod. 77 (3), 577-588 (2007).
- Fliniaux, I., Viallet, J. P., Dhouailly, D., Jahoda, C. A. Transformation of amnion epithelium into skin and hair follicles. Differentiation. 72 (9-10), 558-565 (2004).
- Miki, T., Lehmann, T., Cai, H., Stolz, D. B., Strom, S. C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells. Stem Cells. 23 (10), 1549-1559 (2005).
- Avila, M., Espana, M., Moreno, C., Pena, C. Reconstruction of ocular surface with heterologous limbal epithelium and amniotic membrane in a rabbit model. Cornea. 20 (4), 414-420 (2001).
- Sankar, V., Muthusamy, R. Role of human amniotic epithelial cell transplantation in spinal cord injury repair research. Neuroscienze. 118 (1), 11-17 (2003).
- Yuge, I., et al. Transplanted human amniotic epithelial cells express connexin 26 and Na-K-adenosine triphosphatase in the inner ear. Transplantation. 77 (9), 1452-1454 (2004).
- Li, H., et al. Immunosuppressive factors secreted by human amniotic epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (3), 900-907 (2005).
- Liu, T., et al. Human amniotic epithelial cells ameliorate behavioral dysfunction and reduce infarct size in the rat middle cerebral artery occlusion model. Shock. 29 (5), 603-611 (2008).
- Venkatachalam, S., et al. Novel neurotrophic factor secreted by amniotic epithelial cells. Biocell. 33 (2), 81-89 (2009).
- Manuelpillai, U., et al. Human amniotic epithelial cell transplantation induces markers of alternative macrophage activation and reduces established hepatic fibrosis. PLoS One. 7 (6), e38631 (2012).
- Wei, J. P., et al. Human amnion-isolated cells normalize blood glucose in streptozotocin-induced diabetic mice. Cell Transplant. 12 (5), 545-552 (2003).
- Murphy, S., et al. Human amnion epithelial cells prevent bleomycin-induced lung injury and preserve lung function. Cell Transplant. 20 (6), 909-923 (2011).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells induced to express functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. PLoS One. 7 (9), e46533 (2012).
- Murphy, S. V., et al. Human amnion epithelial cells do not abrogate pulmonary fibrosis in mice with impaired macrophage function. Cell Transplant. 21 (7), 1477-1492 (2012).
- Hodges, R. J., Lim, R., Jenkin, G., Wallace, E. M. Amnion epithelial cells as a candidate therapy for acute and chronic lung injury. Stem cells Int. 2012, 709763 (2012).
- Tan, J. L., Chan, S. T., Wallace, E. M., Lim, R. Human amnion epithelial cells mediate lung repair by directly modulating macrophage recruitment and polarization. , (2013).
- Litvinov, S. V., et al. Epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) modulates cell-cell interactions mediated by classic cadherins. J Cell Biol. 139 (5), 1337-1348 (1997).
- Winter, M. J., Nagtegaal, I. D., van Krieken, J. H., Litvinov, S. V. The epithelial cell adhesion molecule (Ep-CAM) as a morphoregulatory molecule is a tool in surgical pathology. The American journal of pathology. 163 (6), 2139-2148 (2003).
- Musina, R. A., Bekchanova, E. S., Sukhikh, G. T. Comparison of mesenchymal stem cells obtained from different human tissues. Bull Exp Biol Med. 139 (4), 504-509 (2005).
- Park, A., et al. . Newborn Stem Cells: Identity, Function, and Clinical Potential. , 119-137 (2013).
