Su larga scala Zebrafish embrionali Cuore dissezione per l'analisi trascrizionale

Summary

Per analizzare i profili di espressione genica cardiaco durante lo sviluppo del cuore zebrafish, RNA totale deve essere estratto dai cuori isolati. Qui, vi presentiamo un protocollo per la raccolta funzionali / cuori che battono per una rapida dissezione manuale da embrioni di zebrafish per ottenere mRNA specifici cardiaco.

Abstract

Il cuore embrionale zebrafish è composto da poche centinaia di cellule, che rappresentano solo una piccola frazione dell'intero dell'embrione. Pertanto, per evitare che il trascrittoma cardiaco venga mascherato dal trascrittoma embrionale globale, è necessario raccogliere un numero sufficiente di cuore per ulteriori analisi. Inoltre, lo sviluppo cardiaco zebrafish procede rapidamente, raccolta cuore e metodi di estrazione di RNA devono essere veloce per garantire l'omogeneità dei campioni. Qui, vi presentiamo un protocollo dissezione manuale rapido per la raccolta funzionali / cuori che battono da embrioni di zebrafish. Questo è un presupposto essenziale per la successiva estrazione di RNA specifico cardiaco-per determinare cardiaco-specifici livelli di espressione genica per analisi trascrittomica, come ad esempio Real time PCR quantitativa (RT-qPCR). Il metodo si basa sulle proprietà adesive differenziali del cuore embrionale zebrafish rispetto ad altri tessuti; questo permette la rapida PHYSeparazione Sical di cardiaca dal tessuto extracardiache da una combinazione di fluidica perturbazione forza di taglio, filtrazione graduale e la raccolta manuale dei transgenici cuori fluorescente.

Introduction

Zebrafish (Danio rerio) è ampiamente usato in biologia dello sviluppo per studiare organogenesi in vivo per la sua veloce, trasparente e extrauterina sviluppo embrionale, combinato con dimensioni ridotte e la disponibilità di linee giornalista transgeniche con espressione tessuto-specifica di proteine ​​fluorescenti. Questo piccolo vertebrato è particolarmente adatto per studiare lo sviluppo cuore perché l'ossigenazione del primo embrione zebrafish non si basa sul battito cardiaco e il flusso di sangue; queste caratteristiche hanno permesso la caratterizzazione di un gran numero di mutanti cardiovascolari ^1,2 e il pesce zebra è ora un....

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali della legge tedesca e lo stato di Berlino; gestione zebrafish è stato monitorato dalle autorità locali per la protezione degli animali (LAGeSo, Berlin-Brandenburg).

1. Ottenere embrioni di zebrafish per Cuore Estrazione

1. Croce zebrafish giornalista cardiaca come il Tg (myl7: EGFP) ^twu34 linea transgenica ⁹ al fine di ottenere embrioni con espressione GFP-specific cuore.
2. Mantenere gli embrioni in acqua uovo a 28,5 ° C, fino alla fase embrionale desiderato ^10,11. Assicurarsi che la popolazione embrione raccolto è om....

Results

Qui, descriviamo un esperimento rappresentativo dissezione cuore con il pesce zebra Tg (myl7: GFP) ^twu34 transgenici linea ^9, che esprime la proteina verde fluorescente (GFP) esclusivamente all'interno del miocardio (Fig. 1). Abbiamo raccolto sia il cuore sezionato e gli embrioni da cui sono stati ricavati per valutare la purezza del campione cuore. In breve, omozigote Tg (myl7: GFP) ^twu34 zebrafish ⁹ sono stati outcrossed con wild-type in modo che tutti i cu.......

Discussion

Questo protocollo permette il rapido arricchimento di zebrafish tessuto cardiaco embrionale per analisi dell'espressione genica. La quantità e la qualità del campione RNA cardio-specifica dipende molto pochi passi fondamentali: in primo luogo, la quantità di campione viene notevolmente migliorata se la perdita di cuori è impedito ad ogni passo del protocollo, poiché la purificazione dell'RNA funziona solo con sufficiente materiale di partenza. In secondo luogo, la purezza del campione, che dipende interamente sp.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Attrezzature per l'allevamento dei pesci e la raccolta delle uova			vedere il Zebrafish Book11 per i dettagli
Stereomicroscopio
Microcentrifuga
Spettrofotometro			UVad es. Thermo Scientific Nanodrop 2000
di elettroforesi degli acidi nucleiciPiastre di Petri da 4 cm Ø, rivestite con agarosio all'1% in terreno
Micropipette e puntali (P20, P100, P1000)
Provette da centrifugazione da 1,5 ml Provette
			da centrifugazione da 15 ml e 50 ml
Coppia di pinze
Dumont #5ExactaCruz&commercio; Puntali rotondi per il caricamento di gel in rack sterile, 1-200μ l	Santa Cruz	sc-201732
100 μ m filtro (BD Falcon 100 mm Cell Strainer)	BD Biosciences	352360
30 μ m filtro (Filtri di pre-separazione-30 & micro; m)	Miltenyi Biotec	130-041-407
Gel ad aggancio di fase, pesante, tubi da 1,5 ml	Prime	2302810
Acqua d'uovo media			60 μ g/ml Sali marini oceanici istantanei in ddH2O, 0,00001% (p/v) blu di metilene
E3 medio			5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO4
Tricaina (acido 3-amminobenzoicoestere)	Sigma-Aldrich	A-5040	4 mg/ml Soluzione madre di tricaina, pH 7
1% agarosio (in terreno E3)
1% gel di agarosio (in tampone TBE)
Leibovitz´ s L-15 medio	Gibco	21083-027
FBS (Siero Fetale Bovino)	Sigma	F4135
RNAlater	Ambion	AM7020
Trizol	Ambion	1559606
Glicogeno	Invitrogen	10814-010	20 µ g/µ l in acqua priva di RNasi,
cloroformio,
isopropanolo
al 75% (in DEPC-ddH2O)
Acqua priva di nucleasi o ddH2O
tampone
, tampone TBE (Tris/Borato/EDTA) per elettroforesi