Физиологические Записи и РНК Секвенирование Вкусовые придатков Желто-лихорадки комаров<em> Комар желтолихорадочный</em
Summary
Использование двух методов оценки экспрессии генов в крупных вкусовых придатков Комар желтолихорадочный, мы определили набор генов, предположительно, лежащих в основе нейронных ответов на горьких и отталкивания соединений, а определяется электрофизиологического исследования.
Abstract
Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.
Introduction
Соединения, как DEET, Picaridin, цитронеллаль и IR3535 было показано, что эффективно отпугивания комаров, в том числе важных переносчиков болезней Комар желтолихорадочный 1,2. Мы записываем потенциалы действия от сенсорных нейронов, связанных с конкретной вкусовой сенсилл для определения клеток, участвующих с москитной отталкивающей. В сочетании с выходным последовательности экспрессируются гены в этих тканях, мы можем выявить гены, скорее всего, посреднические ответов этих клеток, направленных на выявление новых соединений для улучшения возможностей для отпугивания.
Секвенирование РНК является мощным инструментом, быстро становится стандартом для отслеживания временных и пространственных изменений экспрессии генов. Секвенирование РНК анализы насекомых хемосенсорных придатков и органов были использованы для выявления молекулярные рецепторы в нескольких видов насекомых 3-5, значительно улучшая на обычной ПЦР на основе поисков гена геном 6. Насекомые представляют собой наиболее разнообразную класс животных, предварительноляющих много возможностей изучать связь между генами и уникальных фенотипов. Секвенирование РНК технология может быть использована на любой живой насекомых ткани. Кроме того, электрофизиологические записи от сенсорных клеток в вкусовой uniporous сенсилл может быть достигнуто во многих различных видов насекомых. Спаривание этих двух методов позволяет исследователям сузить набор генов, участвующих в наблюдаемой хемосенсорной фенотипа. Различные виды представит конкретные проблемы, но может сообщить связь между хемосенсорных рецепторных генов и адаптации хемосенсорной. Размер и морфология хемосенсорной сенсилл является переменной и может потребовать ремонта ошибок при записи потенциалов действия, чтобы снизить уровень шума и определить повторяющиеся сигналы. Вскрытия хемосенсорного органов может быть тривиальным или деликатный и требует много времени, в зависимости от морфологии и размера насекомого. Восстановление из высококачественной РНК может потребовать их устранению, а также, например, избегая определенных пигментов воКоллекция тканей.
В то время как демонстрации влияния отталкивающих соединений через поведенческих испытаний является прямым и информативным, этот подход затрат времени и широкое по отношению к механизму действия. Электрофизиологии в сочетании с Секвенирование РНК позволяет более конкретных анализов, что движет уклонения от поведения насекомых. После того, как "инструментарий" химической дискриминации были выявлены в видов насекомых, более конкретные попытки улучшить известные репелленты возможно. Рецепторы и связанные с ними белков в чувствительных клетках, ответственных за эти поведения могут быть выражены гетерологично для непосредственного химического скрининга. Кроме того, молекулярное моделирование может предсказать, какие химические вещества будут вызывать сильные реакции от этих рецепторов 7.
Снимок всех активных генов в узком наборе хемосенсорных тканей также могут быть полезны в идентификации подобных генов у других видов. Использование гомологию последовательности и выражения сиmilarities, исследователи могут сформировать наборы молекулярных рецепторов, скорее всего, посреднических ответов на репеллентов, которые в целом эффективным против насекомых. Мы приведем следующий протокол, чтобы помочь исследователям в деконструкции насекомых хемосенсорных пути и убедить более углубиться в Нейроэтология не-модели и экономически важных насекомых.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее сложным аспектом потенциалов действия записи из вкусовой сенсилл решает, какие ответы "нормально". При использовании одного наконечника вкусовые сенсиллу записи в первый раз для данного вида насекомых, общее количество и чувствительности вкусовых нейронов рецепторов (G…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5mL collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
Riferimenti
- Klun, J. A., Khrimian, A., Debboun, M. Repellent and deterrent effects of SS220, picaridin, and DEET suppress human blood feeding by Aedes aegypti, Anopheles stephensi, and Phlebotomus papatasi. J. Med. Entomol. 43 (1), 34-39 (2006).
- Dickens, J. C., Bohbot, J. D. Mini review: Mode of action of mosquito repellents.Pestic. Biochem. Physiol. 106 (3), 149-155 (2013).
- Pitts, R. J., Rinker, D. C., Jones, P. L., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Transcriptome profiling of chemosensory appendages in the malaria vector Anopheles gambiae reveals tissue- and sex-specific signatures of odor coding. BMC Genomics. 12 (271), (2011).
- Zhou, X., Slone, J. D., Rokas, A., Berger, S. L., Liebig, , et al. Phylogenetic and transcriptomic analysis of chemosensory receptors in a pair of divergent ant species reveals sex-specific signatures of odor coding. PLOS Genet. 8 (8), e1002930 (2012).
- Shiao, M., Fan, W., Fang, S., Lu, M. J., Kondo, R., Li, W. Transcriptional profiling of adult Drosophila antenna by high-throughput sequencing. Zoological Studies. 52 (42), (2013).
- Bohbot, J., Pitts, R. J., Kwon, H. W., Rützler, M., Robertson, H. M., Zwiebel, L. J. Molecular characterization of the Aedes aegypti odorant receptor gene family. Insect Mol. Biol. 16 (5), 525-537 (2007).
- Kain, P., Boyle, S. M., Tharadra, S. K., Guda, T., Pham, C., et al. Odour receptors and neurons for DEET and new insect repellents. Nature. 502 (7472), 507-512 (2013).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. The physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Robinson, A. P., Duursma, R. A., Marshall, J. D. A regression-based equivalence test for model validation: shifting the burden of proof. Tree Physiol. 25 (7), 903-913 (2005).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-seq. Nat. Methods. 5 (7), 621-628 (2008).
- Trapnell, C., Williams, B. A., Pertea, G., Mortazavi, A., Kwan, G., et al. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 28 (5), 511-515 (2010).
- Sanford, J. L., Shields, V. D. C., Dickens, J. C. Gustatory receptor neuron responds to DEET and other insect repellents in the yellow-fever mosquito, Aedes aegypti. Naturwiss. 100 (3), 269-273 (2013).
- Sparks, J. T., Vinyard, B. T., Dickens, J. C. Gustatory receptor expression in the labella and tarsi of Aedes aegypti. Insect Biochem. Mol. Biol. 43 (12), 1161-1171 (2013).
- Kent, L. B., Walden, K. K. O., Robertson, H. M. The Gr family of candidate gustatory and olfactory receptors in the yellow-fever mosquito Aedes aegypti. Chem. Senses. 33 (1), 79-93 (2008).
- Ramsköld, D., Wang, E. T., Burge, C. B., Sandberg, R. An abundance of ubiquitously expressed genes revealed by tissue transcriptome sequence data. PLoS Comput. Biol. 5 (12), e1000598 (2009).
- Wagner, G. P., Kin, K., Lynch, V. J. A model based criterion for gene expression calls using RNA-seq data. Theory Biosci. 132 (3), 159-164 (2013).
- Hart, T., Komori, H. K., LaMere, S., Podshivalova, K., Salomon, D. D. Finding active genes in deep RNA-seq gene expression studies. BMC Genomics. 14 (778), (2013).
- Isono, K., Morita, H. Molecular and cellular designs of insect taste receptor system. Front. Cellu. Neurosci. 4 (20), 1-16 (2010).
