생리 녹음 및 황열병 모기의 미각 부속 기관의 RNA 시퀀싱<em> Aedes aegypti</em
Summary
전기 생리 학적 시험에 의해 측정 Aedes aegypti의 주요 부속 미각 유전자 발현을 추정하기 위해 두 가지 방법을 사용하여, 우리는, 추정되는 쓴맛 반발 화합물 신경 반응을 기본 유전자 세트를 확인했다.
Abstract
Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.
Introduction
DEET, 피카, 시트로 넬랄 및 IR3535 등의 화합물을 효과적으로 1,2 aegypti 중요한 질병 벡터 Aedes을 포함하여 모기를 격퇴하는 것으로 나타났다. 우리는 모기 반발과 관련된 세포를 결정하기 위해 특정 미각 sensilla과 관련된 감각 뉴런에서 활동 전위를 기록한다. 이러한 조직에서 발현 유전자의 하류 서열과 결합, 우리는 개선 발수 기능에 대한 새로운 화합물을 스크리닝하기 위해 가장 가능성이 세포의 반응을 매개하는 유전자를 식별 할 수있다.
RNA-SEQ 신속 유전자 발현에 시간적, 공간적 변화를 추적하기위한 표준이되고, 강력한 도구입니다. RNA-서열은 곤충 화학 감각 부속 분석과 기관은 크게 유전자 (6)에 의해 기존의 PCR 기반 검색 유전자에 개선, 여러 종의 곤충 3-5 분자 수용체를 발견하는 데 사용되었다. 곤충은 가장 다양한 동물 클래스를 나타냅니다, 사전많은 기회를 공무 원은 유전자와 독특한 표현형 사이의 연결을 공부한다. RNA-서열 기술은 살아있는 곤충 조직에 이용 될 수있다. 마찬가지로, 미각 uniporous sensilla 감각 세포 내에서 전기 생리 학적 기록은 다양한 곤충 종으로 달성 될 수있다. 이 두 기술의 페어링은 연구자가 관찰 화학 감각 표현형에 포함 된 세트 유전자를 좁힐 수 있습니다. 다른 종은 특정 과제를 제시하지만, 화학 감각 수용체 유전자와 화학 감각 적응 사이의 연결을 알릴 수있다. 크기와 화학 감각 sensilla의 형태는 가변적이며 노이즈를 줄이고 반복 신호를 식별하는 활동 전위를 기록 할 때 광범위한 문제 해결이 필요할 수 있습니다. 화학 감각 기관의 해부는 사소한 또는 섬세하고 시간이 곤충의 형태와 크기에 따라 소비 할 수있다. 고품질 RNA의 이러한 복구 중에 특정의 안료를 피로서뿐만 아니라, 약간의 문제가 필요할 수조직 수집.
행동 시험을 통해 발수 화합물의 효과를 입증하는 직접적이고 유익한 반면,이 방법은 시간의 동작 메커니즘에 대해서 집중적 넓다. RNA-서열과 결합 전기 생리학은 곤충 회피 행동을 원동력의보다 구체적인 분석이 가능합니다. 화학 차별 "툴킷"곤충 종 식별되면,보다 구체적인 시도는 알려진 방충제이 가능에 향상시킬 수 있습니다. 이러한 행동에 대한 책임을 감각 세포의 수용체와 관련된 단백질은 직접 화학적 스크리닝을 위해 이종 표현 될 수있다. 또한, 분자 모델링 화학 물질이 수용체 7에서 강한 반응을 이끌어내는 것이다 예측할 수있다.
화학 감각 조직의 좁은 세트의 모든 활성 유전자의 스냅 샷은 다른 종에서 비슷한 유전자를 식별하는 데 유용 할 수있다. 서열 상 동성 및 표현시 사용milarities, 연구자들은 대부분 곤충에 광범위하게 효과가 기피제에 대한 응답을 매개 분자 수용체의 세트를 형성 할 수있다. 우리는 곤충 화학 감각 경로를 해체 연구자를 돕기 위해 비 모델과 경제적으로 중요한 곤충의 neuroethology으로 탐구하는 것이 더 설득하기 위해 다음과 같은 프로토콜을 제시한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
미각 sensilla에서 녹음 활동 전위의 가장 어려운 측면이있는 응답을 결정하는 것입니다 "정상적인."주어진 곤충 종, 총 수 및 미각 수용체 뉴런의 감도 (GRNs)에 대한 첫 번째 시간을 기록하는 하나의 미각 sensillum 팁을 사용하면됩니다 가능성이 알 수 없습니다. 많은 예비 녹음을 먼저 범위 및 테스트하는 화학 물질의 농도를 결정해야합니다. 이 경우에, 우리는 단일 GRN DEET (도 1)의</strong…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Bryan T. Vinyard of the USDA, Agricultural Research Service, Henry A. Wallace Beltsville Agricultural Research Center, Biometrical Consulting Service, Beltsville, MD for statistical analyses. This work was supported in part by a grant to J.C.D. from the Deployed War Fighter Protection (DWFP) Research Program funded by the Department of Defense through the Armed Forces Pest Management Board (AFPMB).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Glass capillary | A-M Systems | 628000 | Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4" |
| Silver wire | A-M Systems | 7875 | .015" bare |
| Tungsten wire | Alfa Products | 369 | 0.127mm diameter |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11252 | #5SF Inox |
| Refridgerated stage | BioQuip Products | 1429 | Chill Table |
| Preamplifier | Syntech | Taste Probe | preamplifier |
| Software for electrophysiology | Syntech | Autospike | software for electrophysiology |
| TetraMin fish food | Tetra | Tropical fish food granules | fish food ground to fine powder |
| TRIzol | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation reagent |
| RNeasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74136 | includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns |
| Nanodrop spectrophotometer | Nano Drop Products | ND-1000 | tabletop spectrometer |
| R statistics | freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka) | www.r-project.org | Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment. |
| 1.5ml tube rack | Evergreen | 240-6388-030 | Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue. |
| 1.5mL collection tubes with pestle | Grainger | 6HAX6 | RNase free |
| Centrifuge | Thermo Scientific | 11178160 | Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube. |
| Primer-BLAST Primer Designing tool | NCBI | n/a |
Riferimenti
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