Fysiologiske Recordings og RNA sekvensering av Gustatory vedheng av Yellow-feber Mosquito<em> Aedes aegypti</em

Summary

Ved hjelp av to metoder for å anslå genuttrykk i de store smaks vedheng av Aedes aegypti, har vi identifisert et sett av gener putatively bak de nevrale responser til bitre og frastøtende forbindelser, som bestemmes av elektrofysiologisk undersøkelse.

Abstract

Electrophysiological recording of action potentials from sensory neurons of mosquitoes provides investigators a glimpse into the chemical perception of these disease vectors. We have recently identified a bitter sensing neuron in the labellum of female Aedes aegypti that responds to DEET and other repellents, as well as bitter quinine, through direct electrophysiological investigation. These gustatory receptor neuron responses prompted our sequencing of total mRNA from both male and female labella and tarsi samples to elucidate the putative chemoreception genes expressed in these contact chemoreception tissues. Samples of tarsi were divided into pro-, meso- and metathoracic subtypes for both sexes. We then validated our dataset by conducting qRT-PCR on the same tissue samples and used statistical methods to compare results between the two methods. Studies addressing molecular function may now target specific genes to determine those involved in repellent perception by mosquitoes. These receptor pathways may be used to screen novel repellents towards disruption of host-seeking behavior to curb the spread of harmful viruses.

Introduction

Forbindelser som DEET, Picaridin, citronellal og IR3535 har vist seg å effektivt frastøte mygg, inkludert viktig sykdom vektor Aedes aegypti ^1,2. Vi registrerer aksjonspotensialer fra sensoriske nevroner forbundet med spesifikke gustatory sensilla å bestemme cellene som er involvert med myggavvisende. Sammen med nedstrøms sekvensering av uttrykte gener i disse vev, kan vi identifisere genene mest sannsynlig medier svarene av disse cellene for å screene nye forbindelser for forbedrede avvisende evner.

RNA-seq er et kraftig verktøy, raskt blitt standard for sporing tidsmessige og romlige endringer i genuttrykk. RNA-seq analyser av insekt chemosensory vedheng og organer har blitt brukt til å avdekke molekylære reseptorer i flere insektarter ^3-5, mye bedre på konvensjonell PCR-basert søk genet ved genet ^6. Insekter representerer den mest varierte dyre klasse, prerer mange muligheter til å studere sammenhengen mellom gener og unike fenotyper. RNA-seq teknologi kan brukes på en hvilken som helst levende insekt vev. På samme måte kan elektro opptak fra sensoriske celler i uniporous smaks- sensilla oppnås på mange forskjellige insektarter. Sammenkoblingen av disse to teknikkene tillater forskere å begrense de innstilte gener involvert i en observert chemosensory fenotype. Ulike arter vil presentere konkrete utfordringer, men kan informere sammenhengen mellom chemosensory reseptorgener og en chemosensory tilpasning. Størrelsen og morfologi chemosensory sensilla er variabel og kan kreve omfattende feilsøking ved opptak aksjonspotensialer for å redusere støy og identifisere repeterbare signaler. Dissections av chemosensory organer kan være ubetydelig eller delikat og tidkrevende, avhengig av morfologi og størrelse av insekt. Utvinning av høy kvalitet RNA kan kreve litt feilsøking også, slik som å unngå visse pigmenter undervev samling.

Mens demonstrere virkningene av fordrivende forbindelser gjennom adferdsforsøk er direkte og informativ, er denne tilnærmingen tidkrevende og bred med hensyn til virkningsmekanismen. Elektrofysiologi kombinert med RNA-seq åpner for mer spesifikke analyser av hva som driver unngåelsesatferd i insekter. Når "verktøykasse" kjemisk diskriminering er blitt identifisert i en insektarter, til mer spesifikke forsøk på å forbedre den kjente insektfordrivende midler er mulig. Reseptorer og tilhørende proteiner i sanseceller som er ansvarlige for disse atferd kan uttrykkes heterologt for direkte kjemisk screening. Videre kan molekylær modellering forutsi hvilke kjemikalier vil lokke fram sterke reaksjoner fra disse reseptorene ^7.

Den øyeblikksbilde av alle aktive gener i et smalt sett av chemosensory vev kan også være nyttig for å identifisere tilsvarende gener i andre arter. Ved hjelp sekvenshomologi og uttrykk similarities, forskere kan danne sett av molekylære reseptorer mest sannsynlig medierende reaksjoner på insektmidler blir om lag effektive på insekter. Vi presenterer følgende protokoll for å hjelpe forskere i å dekonstruere insekt chemosensory stier og å overtale flere til å fordype deg i neuroethology av ikke-modellen og økonomisk viktige insekter.

Protocol

1. stell Ae. aegypti voksne Luke egg i ca ¾ tommers vann i grunne skuff. Overbefolkning vil redusere størrelsen på voksne. Bakre larver ved 25 ° C (12-HL: 12-HD) og mate med bakken fisk mat. MERK: fôring kan redusere overlevelse. Fjern puppe individuelt ved Pasteur pipette daglig og overføre til plast retter (9 cm x 5,5 cm) inne små containment bøtter med finmaskede lokk, og dermed etablere 24 timers aldersgrupperinger. Strøm voksne mygg 10% sukroseløsni…

Representative Results

Spor opptak av aksjonspotensialer fra Ae. aegypti smaks- sensilla (figur 1) viser effektiviteten av direkte stimulering med en rekke kjemikalier. Denne teknikken kan brukes til å kvantifisere reaksjoner på en hvilken som helst kjemisk stimulering ved telling av toppene av en gitt amplitude og varighet i løpet av et rimelig tidsrom (vanligvis mindre enn 500 ms). Spor opptak må være lett reproduserbar under et gitt sett av eksperimentelle betingelser. Ellers kan de observerte fysiologiske re…

Discussion

Den mest utfordrende delen av opptaket aksjonspotensialer fra gustatory sensilla er å avgjøre hvilke reaksjoner er "normal". Når ansette enkelt gustatory sensillum tips opptak første gang for en gitt insektarter, totalt antall og sensitiviteter av smaks reseptor nevroner (GRNs) er sannsynlig ukjent. Mange foreløpige opptak blir først nødvendig for å bestemme omfanget og konsentrasjoner av kjemikalier for å teste. I dette tilfellet starter vi med den observasjon at en enkelt grn svarte til lave konsent…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Glass capillary	A-M Systems	628000	Standard, 1.5mm X 0.86mm, 4"
Silver wire	A-M Systems	7875	.015" bare
Tungsten wire	Alfa Products	369	0.127mm diameter
Fine forceps	Fine Science Tools	11252	#5SF Inox
Refridgerated stage	BioQuip Products	1429	Chill Table
Preamplifier	Syntech	Taste Probe	preamplifier
Software for electrophysiology	Syntech	Autospike	software for electrophysiology
TetraMin fish food	Tetra	Tropical fish food granules	fish food ground to fine powder
TRIzol	Life Technologies	15596-026	RNA isolation reagent
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74136	includes gDNA eliminator and RNeasy spin columns
Nanodrop spectrophotometer	Nano Drop Products	ND-1000	tabletop spectrometer
R statistics	freeware (created by Robert Gentleman and Ross Ihaka)	www.r-project.org	Use the lm function of the stats package and the equiv.boot function of the equivalence package in the R computing environment.
1.5ml tube rack	Evergreen	240-6388-030	Pour liquid nitrogen into a few empty wells to freeze and grind tissue.
1.5mL collection tubes with pestle	Grainger	6HAX6	RNase free
Centrifuge	Thermo Scientific	11178160	Spin down frozen tissue to keep at bottom of 1.5 mL tube.
Primer-BLAST Primer Designing tool	NCBI	n/a