L'isolamento potenziato Hsp104 Varianti Utilizzando lievito Proteinopathy modelle

Sommario

I modelli di proteinopatia del lievito sono strumenti preziosi per valutare la tossicità e l'aggregazione delle proteine implicate nella malattia. Qui, presentiamo i metodi per lo screening delle librerie di varianti Hsp104 per i soppressori di tossicità. Questo protocollo potrebbe essere adattato per lo screening di qualsiasi libreria proteica per soppressori di tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

Abstract

Molti disturbi del misfolding proteico possono essere modellati nel lievito Saccharomyces cerevisiae. Proteine come TDP-43 e FUS, implicate nella sclerosi laterale amiotrofica, e α-sinucleina, implicata nella malattia di Parkinson, sono tossiche e formano aggregati citoplasmatici nel lievito. Queste caratteristiche ricapitolano le patologie proteiche osservate nei pazienti con questi disturbi. Pertanto, il lievito è una piattaforma ideale per isolare i soppressori di tossicità da librerie di varianti proteiche. Siamo interessati all'applicazione delle disaggregasi proteiche per eliminare i conformeri proteici tossici mal ripiegati. In particolare, stiamo ingegnerizzando Hsp104, una proteina esamerica AAA+ dal lievito che è in grado di solubilizzare sia gli aggregati disordinati che l'amiloide e di riportare le proteine alle loro conformazioni native. Sebbene Hsp104 sia altamente conservato negli eucarioti e negli eubatteri, non ha alcun omologo metazoo noto. Hsp104 ha solo una capacità limitata di eliminare gli aggregati disordinati e le fibre amiloidi implicate nelle malattie umane. Pertanto, miriamo a ingegnerizzare varianti di Hsp104 per invertire il misfolding proteico implicato nelle malattie neurodegenerative. Abbiamo sviluppato metodi per lo screening di ampie librerie di varianti di Hsp104 per la soppressione della proteotossicità nel lievito. Poiché i lieviti sono inclini alla soppressione spontanea aspecifica della tossicità, è stato sviluppato un processo di screening in due fasi per eliminare i falsi positivi. Utilizzando questi metodi, abbiamo identificato una serie di varianti potenziate di Hsp104 che sopprimono potentemente la tossicità e l'aggregazione di TDP-43, FUS e α-sinucleina. Qui, descriviamo questo protocollo ottimizzato, che potrebbe essere adattato a librerie di screening costruite utilizzando qualsiasi spina dorsale proteica per la soppressione della tossicità di qualsiasi proteina tossica nel lievito.

Introduzione

Lievito proteinopathy modelli sono stati sviluppati per i disordini di proteine ​​misfolding tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) e la malattia (PD) ^1-3 di Parkinson. L'espressione delle proteine ​​TDP-43 e FUS, che misfold nei pazienti con SLA, sono tossici e mislocalize a formare aggregati citoplasmatici in lievito ^1,2. Analogamente, l'espressione di α-sinucleina (α-syn), che è implicato nel PD, è tossico e mislocalizes formare aggregati citoplasmatici in lievito ^3. Queste caratteristiche ricapitolano fenotipi in pazienti con questi disturbi ^4,5. Così, i modelli di lievito forniscono una piattaforma util....

Protocollo

1. Biblioteca Generation

1. Per costruire librerie di Hsp104 utilizzando soggetto a errori PCR specifico del dominio, prima amplificare il dominio di interesse con un errore DNA polimerasi inclini ^20.
2. Purificare il prodotto di PCR mediante estrazione gel.
3. Eseguire un passo estensione megaprimer utilizzando un protocollo standard di mutagenesi sito-diretta: unire 50 ng modello plasmide, 250 ng megaprimer, 200 mM dNTP, e ad alta fedeltà polimerasi DNA in tampone PCR, e portare a 50 ml volume totale di acqua di grado PCR ²⁰ . Eseguire un programma standard di PCR.
   NOTA: primer specifici usati varieranno in base al....

Risultati

Abbiamo costruito una libreria di varianti Hsp104 randomizzati nel dominio centrale e proiettato per la soppressione di TDP-43 tossicità. La biblioteca è stata trasformata e placcato su glucosio e galattosio piastre (Figura 2) per valutare la severità dello schermo. Singole colonie sono stati selezionati e ceppi sono stati selezionati contatore utilizzando 5-FOA per eliminare il plasmide Hsp104. Questi ceppi sono stati poi valutati per confermare che la tossicità era dovuta al TDP-43 da solo, senza le v.......

Discussione

Qui vi presentiamo il nostro approccio per isolare le varianti Hsp104 potenziati che sopprimono la tossicità di substrati associate alla malattia che utilizzano modelli di lievito proteinopathy. Usando questo approccio, grandi librerie di varianti possono essere proiettati in alta velocità, con l'unica limitazione è il numero di varianti che passano schermo secondario 5-FOA. Per eseguire le operazioni descritte in 96 formati bene, abbiamo regolarmente dello schermo fino a 200 colpi alla volta nella fase 5-FOA nel co.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
GeneMorphII EZClone Domain Mutagenesis Kit	Agilent	200552
piastre di Petri da 150 mm	Falcon	351058
5-Fluorootic Acid	Research Products International	f10501-5.0
96-DeepWell 2 ml Piastre	Eppendorf	0030 502.302
96 strumento replicatore audace	V& P Scientific	vp-404
ExoSAP-IT	Affymetrix	78200