Stærkt Effektiv Ligering af Small RNA-molekyler til microRNA kvantificering af High-gennemløb sekventering
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna kloning og high-throughput sekventering, kaldet miR-Seq, står alene som en transkriptom tilgang at kvantificere miRNA med enkelt nukleotid opløsning. Denne teknik indfanger miRNA ved at fastgøre 3 'og 5' oligonukleotidadaptorer til miRNA-molekyler og tillader de novo miRNA opdagelse. Kobling med kraftige næste generation sekventering platforme har MIR-Seq været medvirkende i studiet af miRNA biologi. Imidlertid har betydelige bias indført ved oligonukleotid ligeringstrin forhindret MIR-Seq fra at blive ansat som en nøjagtig kvantificering værktøj. Tidligere undersøgelser viser, at skævheder i de nuværende MIR-Seq metoder ofte føre til unøjagtige miRNA kvantificering med fejl op til 1.000 gange for nogle miRNA 1,2. At løse disse afvigelser bibragt af RNA-ligering, har vi udviklet en lille RNA ligation metode, der resulterer i ligerings- effektivitet på over 95% for både 3 'og 5' ligeringstrin. Benchmarking denne imviste sig at være bibliotek konstruktion metode anvendelse af ækvimolære eller differentielt blandede syntetiske miRNA, konsekvent giver læser tal med mindre end to gange afvigelse fra den forventede værdi. Desuden er denne højeffektiv MIR-Seq Metoden tillader nøjagtig genom-dækkende miRNA profilering fra in vivo total RNA-prøver 2.
Introduction
High-throughput sekventering baseret metoder er blevet almindeligt anvendt til mange biologiske prøver i de senere år i høj grad udvide vores forståelse af den molekylære komplekse biologiske systemer 3,4. Men forberedelsen af RNA-prøver til high-throughput sekventering ofte bibringer særlige bias forbundet til den anvendte metodologi, der begrænser den potentielle nytte af disse kraftfulde teknikker. Disse metode specifik bias er veldokumenteret til ligering-baseret, små RNA-bibliotek præparater 1,2,5,6. Disse skævheder resulterer i 1000-fold variation i læser numre til ækvimolære syntetiske miRNA, hvilket gør følgeslutning af miRNA overflod fra sekventeringsdata vildt variabel og risiko for fejl.
Undersøgelser, der fokuserer på egenskaberne af fag-afledt T4-RNA-ligaser har dokumenteret, at enzymerne udviser nukleotid-baserede præferencer 7, som manifesterer som tendentiøse biblioteker i high-throughput sekventering eksperimenter <sop> 1,2,8. For at minimere bias tilegnes ved RNA-ligaser, flere strategier er blevet anvendt; makromolekylære fortrængning 9 randomisering nukleotidsekvensen på adapteren, som er proksimalt i forhold til ligeringssitet 6, og ved anvendelse af høje koncentrationer af ligering adapter 2. Gennem en kombination af disse tre metoder har vi udviklet et work-flow for saglig fremstilling af små RNA-biblioteker, der er kompatible til high-throughput sekventering (figur 1). For direkte sammenligninger mellem de nuværende protokoller og vores forbedrede metode, henvises til vores seneste rapport 2. Denne optimerede metode giver ligeringsfremgangsmåder effektivitet på mere end 95% ved både 3 'og 5' trin og tillader objektiv ligering af små RNA-molekyler fra syntetiske og biologiske prøver 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den heri beskrevne metode gør brug af flere vigtige variabler for at maksimere effektiviteten ligeringsprodukter, nemlig høje koncentrationer af PEG, anvendelse af randomiserede linkere og høj koncentration af linkere 2,6,9. Denne fremgangsmåde tillader pålideligt kvantitative sekventering biblioteker fra total RNA-prøver 2. Vi har udført flere titreringer af input-RNA og har konkluderet, at den foregående metode er bedst egnet for den samlede RNA-mængder i 1-8 ug område (data ikke vist)….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Riferimenti
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
