Zeer efficiënte Ligatie van Kleine RNA-moleculen voor MicroRNA Kwantificering van High-throughput sequencing
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna klonen en high-throughput sequencing, genaamd miR-Seq, staat alleen als een transcriptome-brede benadering van miRNAs met single nucleotide resolutie kwantificeren. Deze techniek vangt miRNAs door aan 3 'en 5' oligonucleotide adapters miRNA moleculen en maakt de novo miRNA ontdekking. Koppeling met krachtige next-generation sequencing platforms, heeft miR-Seq instrumenteel in de studie van miRNA biologie geweest. Echter, belangrijke vooroordelen geïntroduceerd door oligonucleotideligatie stappen hebben verhinderd miR-Seq wordt gehanteerd als een nauwkeurige kwantificering tool. Eerdere studies tonen aan dat biases in de huidige miR-Seq methoden leiden vaak tot onnauwkeurige miRNA kwantificering met fouten tot 1.000-voudig voor sommige miRNAs 1,2. Om deze vertekeningen verleend door RNA ligatie lossen, hebben we een kleine RNA ligatie werkwijze die leidt tot ligatie efficiëntie van meer dan 95% voor zowel de 3 'en 5' ligatiestappen ontwikkeld. Benchmarking deze imbleek bibliotheek bouwmethode met equimolair of verschillend gemengde synthetische miRNAs consequent levert leest getallen minder dan tweevoudige afwijking van de verwachte waarde. Verder is deze high-efficiency miR-Seq methode maakt nauwkeurige genoom-brede miRNA profilering van in vivo totaal RNA monsters 2.
Introduction
High-throughput sequencing-gebaseerde methoden zijn op grote schaal toegepast voor vele biologische monsters laatste jaren enorm uitbreiden ons begrip van de moleculaire complexiteit van biologische systemen 3,4. Echter, het maken van RNA-monsters voor high-throughput sequencing schenkt vaak specifieke biases die inherent zijn aan de gebruikte methoden, het beperken van de potentiële nut van deze krachtige technieken. Deze methode specifieke vooroordelen zijn goed gedocumenteerd voor-ligatie is op kleine RNA bibliotheek voorbereidingen 1,2,5,6. Deze vooroordelen resulteren in 1.000-voudige variatie in leest nummers voor equimoleculaire synthetische miRNAs, waardoor gevolgtrekking van miRNA overvloed van sequencing data wild variabele en foutgevoelig.
Studies gericht op de eigenschappen van faag afgeleide T4 RNA ligasen hebben aangetoond dat de enzymen vertonen nucleotide gebaseerde voorkeuren 7, die zoals bevooroordeeld bibliotheken in high-throughput sequencing experimenten manifesteren <sup> 1,2,8. Om de vooroordelen verleend door RNA ligasen minimaliseren, verschillende strategieën zijn toegepast; macromoleculaire verdringing 9 randomizing de nucleotide sequentie van de adapter die proximaal is aan de ligatieplaats 6, met gebruikmaking van hoge concentraties ligatie adapter 2. Door een combinatie van deze drie benaderingen hebben we een workflow voor onpartijdige bereiding van kleine RNA bibliotheken geschikt voor high-throughput sequencing (figuur 1) ontwikkeld. Voor een directe vergelijking tussen de huidige protocollen en onze geoptimaliseerde methode, verwijzen wij u naar onze recente rapport 2. Deze geoptimaliseerde methode levert ligatie efficiëntie van meer dan 95% op zowel 3 'en 5' stappen en maakt de onpartijdige ligatie van kleine RNA moleculen uit synthetische en biologische monsters 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven werkwijze maakt gebruik van een aantal belangrijke variabelen ligatie efficiëntie, namelijk hoge concentraties PEG gebruik van gerandomiseerde linkers en hoge concentratie van linkers 2,6,9 maximaliseren. Deze aanpak maakt het mogelijk op een betrouwbare kwantitatieve sequencing bibliotheken uit totaal RNA monsters 2. We hebben meerdere titraties input RNA uitgevoerd en hebben geconcludeerd dat de voorgaande werkwijze is het meest geschikt voor totale RNA bedragen in het berei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Riferimenti
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
