קשירת יעילה ביותר של RNA קטן מולקולות לMicroRNA Quantitation על ידי רצף תפוקה גבוהה
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
שיבוט מירנה ורצף תפוקה גבוהה, המכונים miR-Seq, עומד לבד כגישת transcriptome רחבה לכמת miRNAs עם רזולוציה נוקלאוטיד יחידה. טכניקה זו לוכדת miRNAs על ידי הצמדת מתאמי 3 'ו 5' oligonucleotide למולקולות מירנה ומאפשרת גילוי דה נובו מירנה. צימוד עם פלטפורמות רצף של הדור הבא חזקות, miR-Seq כבר סייע בחקר ביולוגיה מירנה. עם זאת, הטיות משמעותיות שהוצגו על ידי צעדי קשירת oligonucleotide מנעו miR-Seq להיות מועסק ככלי quantitation מדויק. מחקרים קודמים מראים כי הטיות בשיטות miR-Seq הנוכחיים לעתים קרובות להוביל לכימות מדויק מירנה עם שגיאות עד 1,000 פי כמה miRNAs 1,2. כדי לפתור הטיות אלה הנחילה ידי קשירת RNA, שפיתחנו שיטת קשירת RNA קטנה שגורמת ליעילות קשירה של מעל 95% עבור שני 3 'ו 5' צעדי קשירה. בהשוואות im זההוכיח שיטת בניית ספרייה באמצעות miRNAs הסינתטי equimolar או באופן דיפרנציאלי המעורב, באופן עקבי תשואות קוראים מספרים עם סטייה של פחות מכפולה מהערך הצפוי. יתר על כן, שיטת miR-Seq יעילות גבוהה זו מאפשרת יצירת פרופילי מירנה מדויקת הגנום מדגימות רנ"א הכל in vivo 2.
Introduction
מתודולוגיות מבוססות רצף תפוקה גבוהה כבר מיושמות באופן נרחב הרבה דגימות ביולוגיות בשנים האחרונות מאוד להרחיב את ההבנה של המורכבות המולקולרית של מערכות ביולוגיות 3,4. עם זאת, הכנת דגימות RNA לרצף תפוקה גבוהה לעתים קרובות מקנה הטיות ספציפיות הגלומות למתודולוגיה המועסקות, המגבילות את התועלת הפוטנציאלית של טכניקות רבות עוצמה אלה. הטיות שיטה ספציפית הללו תועדו היטב להכנות ספרייה מבוססת-קשירה, הקטן-RNA 1,2,5,6. הטיות אלה מובילים לוריאצית 1,000 פי בקוראים מספרים לmiRNAs הסינתטי equimolar, מה שהופך את ההיסק של שפע מירנה מנתוני רצף נוטים בפראות משתנה וטעייה.
מחקרים המתמקדים במאפיינים של ligases RNA T4-נגזר הפאג תעדו כי האנזימים להציג את העדפות המבוסס על נוקלאוטיד 7, שבאו לידי ספריות מוטות כמו בניסויי רצף תפוקה גבוהה <sעד> 1,2,8. על מנת למזער את ההטיות הנחילה ידי ligases RNA, אסטרטגיות מרובות להיות מועסקת; macromolecular צפיפות 9, באופן אקראי, רצף נוקליאוטידים של מתאם החשמל, הוא הפרוקסימלי לאתר קשירת 6, ומעסיק ריכוזים גבוהים של קשירת מתאם 2. באמצעות שילוב של שלוש הגישות הללו פיתחנו עבודת זרימה להכנה משוחדת של ספריות RNA קטנות תואמות לרצף תפוקה גבוהה (איור 1). להשוואה ישירה בין פרוטוקולים הנוכחיים והשיטה מותאמת שלנו, אנא פנה אל הדו"ח האחרון שלנו 2. שיטה מותאמת זה מניב יעילות קשירה של יותר מ 95% בשני 3 'ו 5' צעדים ומאפשרת קשירה משוחדת של מולקולות RNA קטנות מדגימות סינתטיות וביולוגיות 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
המתודולוגיה שתוארה במסמך זה עושה שימוש במספר משתנה מפתח למקסם את יעילות קשירה, כלומר ריכוז גבוה של PEG, השימוש בlinkers אקראי, וריכוז גבוה של linkers 2,6,9. גישה זו מאפשרת ספריות רצף אמין כמותי מדגימות RNA הכולל 2. ערכנו titrations מרובה של RNA הקלט והגעתי למסקנה כי המתודולוג?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Riferimenti
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
