높은 처리량 시퀀싱에 의한 마이크로 RNA 정량을위한 작은 RNA 분자의 고효율 내고
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
미르 복제 및 높은 처리량 시퀀싱 미르-SEQ는, 단일 염기 해상도의 miRNAs를 정량화하기 위해 사체 차원의 접근 방식으로 독립적이라고. 이 기술은 miRNA의 분자 3 ', 5'올리고 뉴클레오티드 어댑터를 연결하여 miRNA가를 캡처하고 새로이 miRNA의 검색을 할 수 있습니다. 강력한 차세대 시퀀싱 플랫폼과 커플 링,은 miR-SEQ는 miRNA의 생물학의 연구 수단이되어왔다. 그러나, 올리고 뉴클레오티드 결찰 단계에 의해 도입 상당한 편향 정확한 정량 도구로서 사용되는은 miR-SEQ을 방지했다. 이전의 연구는 현재의 miR-SEQ 방법의 편견은 종종 일부 miRNA가 1,2 1,000 배까지 오류가 부정확 한 miRNA의 정량으로 이어질 것을 보여줍니다. RNA 결찰에 의해 부여 이러한 편견을 해결하기 위해, 우리는 모두 3 ', 5'결찰 단계에 대한 95 %의 결찰 효율성을 초래 작은 RNA 결찰 방법을 개발했다. 이 메신저를 벤치마킹지속적으로 기대 값에서보다 두 배 편차 번호를 읽어 산출, 몰 또는 차등 혼합 된 합성의 miRNA를 사용하여 라이브러리 생성 방법을 입증했다. 또한,이 고효율의 miR-SEQ 방법은 생체 내 총 RNA 샘플 2에서 정확한 게놈 전체의 miRNA의 프로파일 링을 허용한다.
Introduction
높은 처리량 시퀀싱 기반의 방법론은 널리 크게 생물학적 시스템 3,4의 분자 복잡성에 대한 우리의 이해를 확장 최근 몇 년 동안 많은 생물학적 시료에 적용되고있다. 그러나, 높은 처리량 시퀀싱 RNA 샘플의 제조는 종종 이러한 강력한 기술의 잠재 성을 제한하는 고용 방법론에 내재 특정 바이어스를 부여한다. 이 방법은 특정 편견 잘 결찰 기반, 작은 RNA 라이브러리 준비 1,2,5,6- 문서화되어있다. 이러한 편견은 1,000 배의 변화에에서 격렬 변수 및 오류가 발생하기 쉬운 시퀀싱 데이터에서 miRNA의 풍요의 추론을, 몰 합성의 miRNA에 대한 숫자를 읽 결과.
파아지 – 유래의 T4 RNA 리가 제의 특성에 초점을 연구 효소는 높은 처리량 시퀀싱 실험에서와 같이 편향된 라이브러리를 나타내 뉴클레오타이드 기반 선호도 7 나타내는 것을 문서화 <s1,2,8>까지. RNA 리가 제에 의해 부여 된 편향을 최소화하기 위하여, 여러 전략이 사용되었다; 거대 분자, 9 군집 결찰 사이트 6 근접한 어댑터 뉴클레오타이드 서열을 랜덤 화하고, 결찰 어댑터 (2)의 높은 농도를 채용. 이 세 가지 방법의 조합을 통해 우리는 높은 처리량 시퀀싱 (그림 1) 호환 작은 RNA 라이브러리의 편견 준비를위한 작업 흐름을 개발했다. 현재의 프로토콜과 우리의 최적화 된 방법 사이의 직접 비교를 위해, 우리의 최근 보고서 2를 참조하시기 바랍니다. 이 최적화 된 방법은 모두 3 '및 5'단계에서 95 % 초과의 결찰 효율을 산출하고, 합성과 생물학적 시료 (2)로부터 소형 RNA 분자의 공평 결찰을 허용한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 방법은 결찰 효율, 즉 PEG, 무작위 링커의 사용의 높은 농도, 및 링커 2,6,9 고농도을 최대화하기 위해 여러 주요 변수를 사용한다. 이 방식은 총 RNA 시료 (2)로부터 안정적으로 정량적 시퀀싱 라이브러리를 허용한다. 우리는 입력 RNA의 다수의 적정을 수행하고 선행하는 방법론 (데이터 미기재) 1-8 μg의 범위에서 총 RNA 량에 가장 적합한 것으로 결론 지었다. 10-500 ng의 범…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Riferimenti
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