Meget Effektiv Ligering av små RNA molekyler for mikroRNA kvantifisering av høy gjennomstrømming Sequencing
Summary
MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.
Abstract
Mirna kloning og high-throughput sekvensering, kalt Mir-Seq, står alene som en transkriptomet omfattende tilnærming til å kvantifisere mirnas med singel nukleotid oppløsning. Denne teknikken fanger mirnas ved å feste 3 'og 5' oligonukleotidadaptorene til miRNA molekyler og lar de novo miRNA oppdagelse. Kobling med kraftige nestegenerasjonssekvense plattformer, har Mir-Seq vært medvirkende i studiet av miRNA biologi. Imidlertid har betydelige fordommer innført ved oligonukleotid-ligeringstrinn forhindres Mir-Seq fra å bli anvendt som en nøyaktig kvantifisering verktøyet. Tidligere studier viser at skjevheter i dagens Mir-Seq metoder ofte føre til unøyaktig miRNA kvantifisering med feil opptil 1000 ganger for noen miRNAs 1,2. For å løse disse skjevheter formidles av RNA ligation, har vi utviklet et lite RNA ligation metode som resulterer i ligation effektivitet på over 95% for både 3 'og 5' ligation trinn. Benchmarking dette imviste bibliotek byggemåten ved hjelp ekvimolære eller forskjellig blandede syntetiske mirnas, konsekvent gir leser tallene med mindre enn to ganger avvik fra forventet verdi. Videre tillater denne høyeffektive Mir-Seq metoden nøyaktig genome-wide miRNA profilering fra in vivo total RNA prøver to.
Introduction
Høy throughput sekvense baserte metoder har blitt mye brukt til mange biologiske prøver i de senere år i stor grad utvide vår forståelse av den molekylære kompleksiteten i biologiske systemer 3,4. Men utarbeidelse av RNA prøver for høy gjennomstrømming sekvense formidler ofte spesifikke skjevheter iboende til arbeidstakeren metodikk, noe som begrenser den potensielle nytten av disse kraftige teknikker. Disse fremgangsmåte spesifikk skjevheter har blitt godt dokumentert for ligering-baserte, små-RNA-bibliotek 1,2,5,6 preparater. Disse skjevheter resultere i 1000-fold variasjon i leser tallene for ekvimolære syntetiske mirnas, slik slutning av miRNA overflod fra sekvense data vilt variabel og feiling utsatt.
Studier som fokuserer på egenskapene til fag-avledet T4 RNA ligaser har dokumentert at enzymene utviser nukleotid-baserte preferanser 7, som manifesterer som partisk bibliotek i high-throughput sekvense eksperimenter <sopp> 1,2,8. For å minimalisere de skjevheter som meddeles ved RNA-ligaser, flere strategier er blitt anvendt; makromolekylært crowding 9, randomisering nukleotidsekvensen på adapteren som er proksimal til ligerings området 6, og ved anvendelse av høye konsentrasjoner av ligeringsadapter 2. Gjennom en kombinasjon av disse tre tilnærmingene har vi utviklet en work-flow for objektiv fremstilling av små RNA biblioteker kompatible for high-throughput sekvensering (figur 1). For direkte sammenligninger mellom nåværende protokoller og vår optimalisert metode, vennligst se vår siste rapport 2. Denne metode gir optimaliserte ligeringseffektivitet større enn 95% ved både 3 'og 5' trinn og tillater objektiv ligering av små RNA molekyler fra syntetiske og biologiske prøver 2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den metodikk som er beskrevet her gjør bruk av flere viktige variable for å maksimere ligerings-effektivitet, nemlig høye konsentrasjoner av PEG, anvendelse av linkere, randomiserte og høy konsentrasjon av 2,6,9-linkere. Denne tilnærmingen tillater pålitelig kvantitative sekvense biblioteker fra total RNA prøver to. Vi har gjennomført flere titreringer av innspill RNA og har konkludert med at den foregående metodikk som er best egnet for total RNA beløp i 1-8 mikrogram området (data ikke…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank members of the Yi laboratory especially Zhaojie Zhang for fruitful discussions regarding linker design and ligation efficiencies, as well as the American Cancer Society for supporting this work through a postdoctoral fellowship (#125209) to J.E.L. Research reported in this publication was also supported by the National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases of the National Institutes of Health under Award Number R01AR059697 (to R.Y.) and a research grant from the Linda Crnic Institute for Down Syndrome. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 3' Linker (5' phosphorylated, 3' blocked) | Integrated DNA Technologies | custom | |
| 5' Linker | Integrated DNA Technologies | custom | 5' blocked, HPLC Purified |
| T4RNL2 (1-249 K227Q) | New England Biolabs | M0351S | Specialized for ligation of pre-adenylated DNA adapters |
| 10X Ligation Buffer (without ATP) | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| 10X Ligation Buffer (with ATP) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| RNaseOUT | Invitrogen | 10777-019 | |
| Polyethylene Glycol (mol. Wt. 8000) | New England Biolabs | Included with M0204L | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | We have found water collected from a distillation apparatus to be of equvalent quality. |
| T4RNL1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Superscript III RT kit | Invitrogen | 18080-051 | |
| Phusion PCR kit | New England Biolabs | M0530S | |
| Illumina RP1 Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina RT Primer | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| Illumina Index Primer(s) | Integrated DNA Technologies | custom | Sequence information available from Illumina |
| 40% Acrylamide | Fisher Scientific | BP14081 | |
| Urea | Sigma Aldrich | U6504 | |
| Ammonium persulfate | Sigma Aldrich | A3678 | |
| Tetramethyethylenediamine (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | |
| 2X Denaturing RNA loading buffer | New England Biolabs | Included with M0351S | |
| Razor blades | VWR | 55411-050 | |
| SpinX Centricon Tubes | Costar | CLS8161 | |
| Low Retention Microfuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | |
| Sybr Gold | Invitrogen | S-11494 | |
| Adenylation Kit | New England Biolabs | E2610L |
Riferimenti
- Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17 (9), 1697-1712 (2011).
- Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14 (10), 109 (2013).
- Consortium, T. E. P. The ENCODE (ENCyclopedia Of DNA Elements) Project. Science. 306 (5696), 636-640 (2004).
- Consortium, T. E. P. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
- Linsen, S. E. V., et al. Limitations and possibilities of small RNA digital gene expression profiling. Nature Methods. 6 (7), 474-476 (2009).
- Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39 (21), 141 (2011).
- McLaughlin, L. W., Romaniuk, E., Romaniuk, P. J., Neilson, T. The Effect of Acceptor Oligoribonucleotide Sequence on the T4 RNA Ligase Reaction. European Journal of Biochemistry. 125 (3), 639-643 (1982).
- Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40 (7), 54 (2012).
- Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12 (21), 8235-8251 (1984).
- Torchia, C., Takagi, Y., Ho, C. K. Archaeal RNA ligase is a homodimeric protein that catalyzes intramolecular ligation of single-stranded RNA and DNA. Nucleic Acids Research. 36 (19), 6218-6227 (2008).
- Lau, N. C., Lim, L. P., Weinstein, E. G., Bartel, D. P. An Abundant Class of Tiny RNAs with Probable Regulatory Roles in Caenorhabditis elegans. Science. 294 (5543), 858-862 (2001).
- Yi, R., et al. DGCR8-dependent microRNA biogenesis is essential for skin development. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (2), 498-502 (2009).
- Leung, A. K. L., et al. Genome-wide identification of Ago2 binding sites from mouse embryonic stem cells with and without mature microRNAs. Nature Structural & Molecular Biology. 18 (2), 237-244 (2011).
