Выявление белок-белковых сайтов взаимодействие по пептидов массивов
Summary
Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.
Abstract
Белок-белковых взаимодействий посредником большинство процессов в живой клетке и управления гомеостаза организма. Нарушениями белковых взаимодействий может привести к болезни, что делает белковых взаимодействий важные цели наркотиков. Таким образом, крайне важно понимать эти взаимодействия на молекулярном уровне. Белковых взаимодействий изучаются с использованием различных методик, начиная от клеточных и биохимических анализов, чтобы количественных биофизических анализов, и они могут быть выполнены либо с полноразмерные белки, с белковыми доменами, или пептидами. Пептиды служить превосходными инструментами для изучения белковых взаимодействий, так как пептиды могут быть легко синтезированы и позволяют упором на конкретных участках взаимодействия. Пептидные массивы позволяют идентифицировать сайты взаимодействие между двумя белками, а также для скрининга пептидов, которые связывают белок-мишень для терапевтических целей. Они также позволяют высокую пропускную способность исследования SAR. Для идентификации сайтов связывания, в typiкал пептид массив обычно содержит частично перекрывающихся 10-20 остатков пептиды, полученные из полных последовательностей одного или нескольких партнеров белков желаемого целевого белка. Скрининг массив для связывания белок-мишень раскрывает обязательные пептиды, соответствующие сайты связывания в белках партнеров, в простой и быстрый метод, используя только небольшое количество белка.
В этой статье мы опишем протокол для скрининга пептидных массивы для отображения сайтов взаимодействия между белком-мишенью и ее партнеров. Массив пептид разработан на базе последовательностей белков-партнеров с учетом их вторичные структуры. Массивы, используемые в настоящем протоколе были Celluspots массивы, подготовленные INTAVIS биоаналитических инструменты. Массив заблокирован, чтобы предотвратить неспецифическое связывание и затем инкубировали с исследуемой белка. Обнаружение с использованием антитела раскрывает связывающие пептиды, соответствующие определенным сайтам взаимодействия между белками.
Introduction
Белок-белковых взаимодействий посредником большинство процессов в живой клетке. Нарушениями белковых взаимодействий может привести к болезни, что делает белковых взаимодействий важные цели наркотиков. Таким образом, крайне важно понимать эти взаимодействия на молекулярном уровне. Белковых взаимодействий изучаются с использованием различных методик, начиная от клеточных и биохимических анализов, чтобы количественных биофизических анализов, и они могут быть выполнены либо с полноразмерные белки, с белковыми доменами, или пептидами. Пептиды служить превосходными инструментами для изучения белковых взаимодействий. Это потому, что пептиды могут быть легко синтезированы и позволяют фокусировки на определенном участке взаимодействия с одной стороны, и на нескольких целевых белков в высокой пропускной образом, с другой стороны 1,2. Скрининг Пептид массив быстро, легко выполнить метод получения большого количества данных о взаимодействиях белка-мишени с многочисленными партнерами в течение короткого времени 3, В отличие от других биохимических или биофизических методов обнаружения и анализа белок-белковых взаимодействий, скрининг пептид массив требует очень низкую концентрацию белка и может обнаружить очень слабое связывание. Пептидные массивы могут быть использованы для многих приложений в пептид-белковых взаимодействий, таких как отображение белок-белок или рецептор-лиганд сайтов взаимодействия 4, гомо- или гетеро-олигомеризации интерфейсов, характеризующие антитела, эпитопы, 5, изучении активности ферментов 6 и высокую пропускную способность корпусного Активность отношения (SAR) изучает 7. Для обзора о скрининге пептид массива углубленного см Кац и др. 4
Несколько типов пептидных массивов в настоящее время существуют. Существуют две основные стратегии синтетические пептидные для создания массива: синтез пептидов перед прикреплением их к твердому носителю, или синтеза пептидов непосредственно на твердом носителе, главным образом, с использованием метода SPOT 4,8.пептиды синтезируют на твердом носителе, как правило, с помощью 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc) химии 8. Среди общих синтетических схем пептид привязанность через N-конца (например, JPT pepstar массивы 9) и привязанность пептид через С-конца (например, PEPSCAN pepchip массивы 10, JPT pepspot массивы 9 и INTAVIS celluspot массивы 11) 4. Твердый носитель может варьировать, и так же химический состав пептидной связью с ней. Cys-концевыми пептиды могут быть прикреплены к предметные стекла с помощью тиольной группы 12. N-конец пептида может быть ковалентно связан с гидроксильной группой на целлюлозной мембране через этерификации аминокислоты присоединены 8.
Здесь мы представляем подробный протокол для скрининга пептидных массивы в качестве метода для изучения белок-белковых взаимодействий. Массив мы использовали массив Celluspots, который является микро-массив, содержащий большое АМОЕНТ пятен (дубликаты до 384 мест) на небольшом целлюлозной мембране, поддерживаемых предметное стекло. Это дает возможность работать при низких объемов белка и антител и получение значительного количества данных в одном эксперименте. Этот массив содержит также высокую плотность пептид, который позволяет обнаруживать низким сродством связывания. Массив был использован для отображения взаимодействия СТИЛ-CHFR, которая очень важна для управления распространением нормальный клеточный 13. Неконтролируемое взаимодействие между двумя белками могут привести к развитию рака. Нанеся на карту этого взаимодействия мы нашли конкретное сайт связывания и связывания остатков 14. Это открывает путь для разработки рациональных ингибиторы, которые препятствуют это взаимодействие белок-белок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Пептид скрининг массив является отличным инструментом для определения сайты связывания белка-мишени в своих партнеров. Этот анализ очень быстро и легко выполнить, а результаты могут быть получены в одном или двух рабочих дней. Пептид скрининг массив является универсальным и может быт…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
AF поддержали исходное гранта от Европейского исследовательского совета при Седьмой рамочной программы Европейского сообщества (FP7 / 2007-2013) / соглашение ERC Грант N ° 203413 и Минерва Центра био-гибридный комплекс systems.HA и ИИ поддерживаются по Dalia и Дэн Майдан стипендий для студентов старших курсов, степень в Еврейском университете в Иерусалиме.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Peptide array | INTAVIS Bioanalytical Instruments | ||
| His-probe Antibody (H-3) HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 HRP | |
| EZ-ECL Kit | Biological industries | 20-500-120 | |
| Skim Milk | Becton, Dickinson and Company | 232100 | |
| LAS-3000 camera | FUJI film |
Riferimenti
- Benyamini, H., Friedler, A. Using peptides to study protein–protein interactions. Future Medicinal Chemistry. 2 (6), 989-1003 (2010).
- Geysen, H. M., Wagner, C. D. Isotope or mass encoding of combinatorial libraries. Chemistry & Biology. 3 (8), 679-688 (1996).
- Frank, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support. Tetrahedron. 48 (42), 9217-9232 (1992).
- Katz, C., Levy-Beladev, L., Rotem-Bamberger, S., Rito, T., Rudiger, S. G., Friedler, A. Studying protein-protein interactions using peptide arrays. Chem Soc Rev. 40 (5), 2131-2145 (2011).
- Hansen, L. B., Buus, S., Schafer-Nielsen, C. Identification and Mapping of Linear Antibody Epitopes in Human Serum Albumin Using High-Density Peptide Arrays. PLoS ONE. 8 (7), (2013).
- Uecker, A. A substrate peptide for the FLT3 receptor tyrosine kinase. British Journal of Haematology. 144 (1), 127-130 (2009).
- Gabizon, R., Faust, O., Benyamini, H., Nir, S., Loyter, A., Friedler, A. Structure-activity relationship studies using peptide arrays: the example of HIV-1 Rev-integrase interaction. Med. Chem. Commun. 4 (1), 252-259 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique: Synthetic peptide arrays on membrane supports—principles and applications. Journal of Immunological Methods. 267 (1), 13-26 (2002).
- Falsey, J. R., Renil, M., Park, S., Li, S., Lam, K. S. Peptide and Small Molecule Microarray for High Throughput Cell Adhesion and Functional Assays. Bioconjugate Chemistry. 12 (3), 346-353 (2001).
- Castiel, A., Danieli, M. M. The Stil protein regulates centrosome integrity and mitosis through suppression of Chfr. Journal of Cell Science. 124 (4), 532-539 (2011).
- Amartely, H., David, A., Lebendiker, M., Benyamini, H., Izraeli, S., Friedler, A. The STIL protein contains intrinsically disordered regions that mediate its protein-protein interactions. Chemical Communications. 50, 5245-5247 (2013).
- Izraeli, S., Lowe, L. A. The SIL gene is required for mouse embryonic axial development and left-right specification. Nature. 399 (6737), 691-694 (1999).
- Izraeli, S., Colaizzo-Anas, T., Bertness, V. L., Mani, K., Aplan, P. D., Kirsch, I. R. Expression of the SIL gene is correlated with growth induction and cellular proliferation. Cell Growth Differ. 8 (11), 1171-1179 (1997).
- Arquint, C., Sonnen, K. F., Stierhof, Y. -. D., Nigg, E. a Cell-cycle-regulated expression of STIL controls centriole number in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1342-1352 (2012).
- Tang, C. J., Lin, S. Y. The human microcephaly protein STIL interacts with CPAP and is required for procentriole formation. Embo J. 30 (23), 4790-4804 (2011).
- Vulprecht, J., David, A. STIL is required for centriole duplication in human cells. Journal of Cell Science. 125 (5), 1353-1362 (2012).
- Campaner, S., Kaldis, P., Izraeli, S., Kirsch, I. R. Sil phosphorylation in a Pin1 binding domain affects the duration of the spindle checkpoint. Mol Cell Biol. 25 (15), 6660-6672 (2005).
- Kasai, K., Inaguma, S., Yoneyama, A., Yoshikawa, K., Ikeda, H. SCL/TAL1 interrupting locus derepresses GLI1 from the negative control of suppressor-of-fused in pancreatic cancer cell. Cancer Res. 68 (19), 7723-7729 (2008).
- Chaturvedi, P., Sudakin, V. Chfr regulates a mitotic stress pathway through its RING-finger domain with ubiquitin ligase activity. Cancer Res. 62 (6), 1797-1801 (2002).
- Olaussen, K. a., Commo, F. Synergistic proapoptotic effects of the two tyrosine kinase inhibitors pazopanib and lapatinib on multiple carcinoma cell lines. Oncogene. 28 (48), 4249-4260 (2009).
- Reingewertz, T. H., Britan-Rosich, E. Mapping the Vif–A3G interaction using peptide arrays: A basis for anti-HIV lead peptides. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 21 (12), 3523-3532 (2013).
- Katz, C., Benyamini, H. Molecular basis of the interaction between the antiapoptotic Bcl-2 family proteins and the proapoptotic protein ASPP2. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12277-12282 (2008).
- Katz, C., Zaltsman-Amir, Y., Mostizky, Y., Kollet, N., Gross, A., Friedler, A. Molecular Basis of the Interaction between Proapoptotic Truncated BID (tBID) Protein and Mitochondrial Carrier Homologue 2 (MTCH2) Protein: KEY PLAYERS IN MITOCHONDRIAL DEATH PATHWAY. Journal of Biological Chemistry. 287 (18), 15016-15023 (2012).
- Rosenberg, M. M., Ronen, D., Lahav, N., Nazirov, E., Ravid, S., Friedler, A. High resolution characterization of myosin IIC tailpiece and its effect on filament assembly. Journal of Biological Chemistry. 288 (14), 9779-9789 (2013).
