마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상
Summary
손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.
Abstract
여기에서 우리는 살아있는 배아 마우스 와우 외식의 장기 시간 경과 이미징을위한 방법을 제시한다. 약 10 일 동안 포유류의 달팽이관 진행의 높은 주문, 복잡한 구조를 구축하기위한 책임을 발달 프로그램. 이 기간 동안 유전자 발현의 변화 및 약제 학적 또는 유전자 조작에 대한 반응을 연구하기 위하여, 장기간의 영상이 필요하다. 이전에는, 라이브 영상은 전형적 표준 현미경 꼭대기 가습 실 내에 이식 된 조직의 생존 능력에 의해 제한되었다. 습도와 온도에 관해서는 배양 성장을위한 최적의 조건을 유지하는데 어려움 이미징 실험의 길이에 제한을 두었다. 수정 된 조직 문화 인큐베이터에 통합 현미경 장기-라이브 영상을위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 이 방법에서 우리는 배아 마우스 와우 외식을 설정하는 방법과 시간 경과 imagi를 수행하는 인큐베이터 현미경을 사용하는 방법을 보여잉 오일 위에 전형적인 배아 일 (E) (13)와 인공 이식편 SOX2, 달팽이관의 prosensory 세포 마커의 거동을 조사 시야와 형광 현미경을 모두 사용.
Introduction
포유류 달팽이관 주문한 높은 복잡한 기관이다. 마우스에서 출생 초기 단계에서 귀의 날 E11에 소포 및 개발 프로그램의 완성에서 원시적 인 내이의 출현 사이에, 세포 신호의 여러 파도와 유전자 발현 조정 변화가 일어난다. 인공 와우 덕트의 삼각 형상에베이스에서 실행하면 코르티 감각 상피, 또는 기관을 검출하는 소리입니다. 코르티 기관의 발전 절묘하게 개발 단부함으로써, 내측 유모 세포의 단일 행으로 구성된다되도록 제어되는, 외부 모세포 3 열의는지지 세포의 다섯 열 (기둥 셀의 두 행, 세 산재 Deiters '셀의 행) 1. , 청력 손실을 기원하고 감각 epithemlium 2의 패턴이 적힌 studye의 중요성을 heighlighting이 정확한 순서로 결과에서 편차.
배아 마우스 COCH의 체외 배양에서레아는 코르티 기관의 발전의 메커니즘을 연구에 필수적인 도구입니다. 이 기술은 1974 년에 설립되었으며, 지난 40 년 동안, 감각 상피 지정 및 코르티 기관 (3)을 설립하는 메커니즘의 많은 것을 해명하는 데 사용되었습니다. 달팽이관은 동적 발달 과정과 복잡한 기관이다; 칠일 1 명시하는 등의 조작은 오래 걸릴 수 있습니다. E13에 인공 이식편 배양에 GSK 3β의 억제제를 추가 할 때 예를 들어, 최적의 잠복기는 화합물의 강력한 효과 육일 4 관찰.
개발 달팽이관의 라이브 영상은 코르티 기관의 형태의 변화로 조사를 할 수 있습니다, 유전자 발현의 변화, 이주의 추적 증식 또는 세포를 죽어가는, 그리고 실시간 제약 에이전트의 결과 관찰 및 신호의 중단을 할 수 있습니다 경로. 지금까지 달팽이관의 영상을 살고주로 단시간 5-8 위에 코르티 기관의 화상 작은 영역에 공 초점 현미경을 사용하여 수행하지만,이 기술은 이식편 생존력으로 인해 한계가있다. 느린 발달 과정에 장기간 조작의 효과의 촬상에서는, 촬상 환경이 매우 중요하다. 일반적으로 공 촛점 라이브 영상 시스템은 현미경에 앉는 가습 플라스틱 상자를 사용한다. 열 및 습도는 대물 또는 광원으로는 힌지 결합 된 개구를 통해 상기 microscope-의 다양한 부분 주위에 갭을 통해, 상기 액세스 창을 통해, 현미경 테이블을 충족 배양 상자의 간극을 통해 빠져 나갈 수. 이 이상의 2-3 일 건강한 이식편을 유지하기위한 최적이 아니다.
우리는 표준 CO 2 인큐베이터 안에 봉인 거꾸로 현미경보다는 현미경 중심으로 인큐베이터 '인큐베이터 현미경'을 정의합니다. 인큐베이터 현미경 전실험의 수명 경향 오히려 2-3 일 이상 촬상보다는 샘플 최대 2 주 동안 묘화 될 수 있도록. 인큐베이터 현미경은 문화와 표준 제어 조건을 절편하기 위해 최소한의 방해로, 세포의 성장과 분화를위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 여러 날에 걸쳐 수행 될 연구에서는 인큐베이터에서 제거하고 거꾸로 형광 현미경을 수행하여 매일 영상 샘플에 의존하는 것이 일반적이다. 이 방법을 사용할 수 있지만, 인큐베이터에서 요리를 제거하면 민감한 개발 조직에 스트레스를 입 힙니다. 때문에 인큐베이터에서 제거에 온도에서 배양 매체와 변동 산도의 변화는 차선의 개발과 건강하지 못한 조직이 발생할 수 있습니다. 동일한 초점 평면에서 모든 시점에서 동일한 방향으로 동일한 영역을 이미징하는 것은 매우 어려운 것이다. 인큐베이터 내에서 자동화 된 시스템을 사용함으로써, 건강하게 유지할 수있다티슈는 더 시점에서 영상을 수집하고 동일한 영역이 매 프레임에서 캡처되도록. 최근에는 여러 개의 집적 현미경 조직 인큐베이터가 개발되어 임상 적으로 이들 9뿐만 아니라 줄기 세포 연구 및 암 (10,11)에서뿐만 아니라 유용했을.
여기에서 우리는 배아 마우스 와우 외식의 장기간의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시한다. 우리가 설정된 시점에서 다중 샘플의 이미지를 캡쳐하기위한 능력을 가진 표준 CO 2 인큐베이터 안에 자동화 현미경 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인큐베이터 안에 설정 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 샘플은 각 시점에서 다중 샘플의 이미징을 허용 회전 단상에 위치한다. 조명, 촬영, 및 연단의 회전 MetaMorph로부터 소프트웨어를 통해 운영 시스템에 의해 자동 제어된다. 운영 소프트웨어를 이용하여 촬상 루틴을 설정함으로써, 우리는 TW까지 동안 작동 실험을 설정할 수간섭을 최소한으로 줄이고 O 주. 이 예에서 우리는 특별히 큰 규모의 성장과 달팽이관의 재 배열하고, prosensory 영역을 보여 모두 시야 및 형광을 사용합니다. 이 실험에서, cochleae는. 배아 일 E13에 SOX2 EGFP 리포터 생쥐 해부한다 체외 배양이 설정됩니다 다음 오일을 통해 몇 군데.
Protocol
Representative Results
Discussion
문화가 설립 장기 이미징 위해 시간 경과 현미경을 설정하는 경우 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 점이있다.
우리는 인공 이식편을 배양 기재로서 기저막 매트릭스를 사용하지만, 기판은 세포 유형에 매칭되어야한다. 예를 들어, 이미지의 연결을 문화, 그것은 피브로넥틴 코팅을 제공하는 것이 더 좋을 수도있다. 항온 처리 온도 및 가스 조성은 또한 조직의 종류에 따라 선택…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
도움의 의견과 건설적인 조언을 세 익명의 검토에 대한 기술 지원을위한 윌리 일 박사 크리스 Gellynck을 부탁드립니다. 이 작품은 Sunnybrook 청각 재생 이니셔티브에 의해 투자되었다
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this | http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
|
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
|
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
|
| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
|
| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
|
| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
|
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
|
| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this | |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
|
| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
|
| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
|
| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
|
| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
|
| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
|
| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
|
| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
|
| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
Riferimenti
- Wu, D. K., Kelley, M. W. Molecular mechanisms of inner ear development. Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).
- Shim, K. The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception. The international journal of biochemistry & cell biology. 38, 1827-1833 (2006).
- Van de Water, T., Ruben, R. J. Growth of the inner ear in organ culture. The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).
- Jacques, B. E., et al. A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea. Development. 139, 4395-4404 (2012).
- Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy. Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).
- Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti. BMC developmental biology. 13, 6 (2013).
- Appler, J. M., et al. Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).
- Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry. Development. 138, 1143-1152 (2011).
- Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging. Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).
- Matsuoka, F., et al. Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells. PloS one. 8, (2013).
- Ma, G. F., et al. et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro. PloS one. 8, (2013).
- Taranova, O. V., et al. SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence. Genes & development. 20, 1187-1202 (2006).
- Chen, P., Segil, N. p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti. Development. , 1581-1590 (1999).
