A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes
Summary
Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.
Abstract
Aquí presentamos un método para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de los explantes cocleares de ratón embrionarias en vivo. El programa de desarrollo responsable de la construcción de la muy ordenada, compleja estructura de los ingresos cóclea de mamíferos durante unos diez días. Con el fin de estudiar los cambios en la expresión génica durante este período y su respuesta a farmacéutico o la manipulación genética, de formación de imágenes a largo plazo es necesario. Anteriormente, imágenes en vivo ha sido típicamente limitada por la viabilidad del tejido explantado en una cámara humidificada encima de un microscopio estándar. Dificultad en el mantenimiento de las condiciones óptimas para el crecimiento del cultivo con respecto a la humedad y la temperatura ha puesto límites en la longitud de los experimentos de imagen. Un microscopio integrado en una incubadora de cultivo de tejidos modificados ofrece un excelente ambiente para la formación de imágenes a largo plazo en directo. En este método se demuestra cómo establecer ratón embrionario explantes cocleares y cómo utilizar un microscopio incubadora para realizar Imagi lapso de tiempong utilizando tanto de campo brillante y microscopía fluorescente para examinar el comportamiento de un día típico embrionario (E) 13 explante coclear y Sox2, un marcador de las células prosensoriales de la cóclea, durante 5 días.
Introduction
La cóclea de los mamíferos es un órgano complejo altamente ordenada. En el ratón, entre la aparición del oído interno primitiva de la vesícula ótica en el día E11 y la finalización del programa de desarrollo en las etapas postnatales tempranas, múltiples oleadas de la señalización celular y los cambios coordinados en la expresión génica se llevan a cabo. Que va desde la base al ápice del conducto coclear es el sonido detectar epitelio sensorial, o el órgano de Corti. Desarrollo del órgano de Corti está exquisitamente controlada de tal manera que al final del desarrollo, que consistirá en una sola fila de células ciliadas internas, tres filas de células ciliadas externas intercalados con cinco filas de células de apoyo (dos filas de células pilar, tres hileras de células Deiters ') 1. La desviación de esta precisos resultados de orden en la pérdida de audición, heighlighting la importancia de studye deEl génesis y el patrón de la epithemlium sensorial 2.
En el cultivo in vitro de la coch ratón embrionariolea es una herramienta esencial en el estudio de los mecanismos de desarrollo del órgano de Corti. Esta técnica fue establecida en 1974 y en los últimos 40 años, ha sido utilizado para dilucidar muchos de los mecanismos por los que se especifica el epitelio sensorial y el órgano de Corti estableció 3. La cóclea es un órgano complejo con los procesos de desarrollo dinámicos; una manipulación puede llegar a tardar hasta siete días para manifestar 1. Por ejemplo, cuando la adición de inhibidores de GSK 3β a un cultivo de explantes cocleares en E13, el período de incubación óptimo para observar un efecto robusta del compuesto es de seis días 4.
Imágenes en vivo de la cóclea permite el desarrollo de investigación sobre los cambios en la morfología del órgano de Corti, los cambios en la expresión génica, el seguimiento de la migración, proliferación o células que mueren, y que permite la observación en tiempo real de los resultados de los agentes farmacéuticos y la alteración de la señalización vías. Hasta ahora, la imagen en directo de la cócleaprincipalmente se ha realizado utilizando microscopía confocal para pequeñas áreas de imagen del órgano de Corti en períodos de tiempo cortos 5-8, pero esta técnica tiene limitaciones debido a la viabilidad de explante. En las imágenes de los efectos de las manipulaciones a largo plazo sobre los procesos de desarrollo lento, el entorno de imagen es crucial. Normalmente, un sistema de imagen confocal en vivo utiliza una caja de plástico humidificado que se sienta en el microscopio. El calor y la humedad pueden escapar a través de los huecos en el cuadro de la incubación de donde se encuentra con la mesa del microscopio, a través de las ventanas de acceso, a través de las aberturas de bisagra y a través de los huecos alrededor de varias partes de la Microscopio- tales como el objetivo o la fuente de luz. Este no es óptimo para el mantenimiento de explantes sanos durante más de dos o tres días.
Definimos 'microscopio incubadora' como un microscopio invertido sellado dentro de un incubador de CO2 estándar, en lugar de una incubadora construida alrededor del microscopio. Un microscopio incubadora extiende la vida del experimento de tal manera que en lugar de formación de imágenes de más de dos o tres días, las muestras se pueden obtener imágenes de hasta dos semanas. Un microscopio incubadora ofrece un excelente ambiente para el crecimiento y la diferenciación celular, con el menor trastorno posible a explante culturas y condiciones estándar controlado. En los estudios que se llevan a cabo a través de múltiples día es común que recurrir a muestras de formación de imágenes sobre una base diaria por la eliminación de ellos de la incubadora y llevándolos a un microscopio de fluorescencia invertido. Si bien este enfoque puede funcionar, la eliminación de los platos de la incubadora inflige presión sobre el tejido en desarrollo sensible. Los cambios en la acidez del medio de cultivo y las fluctuaciones en la temperatura debido a la eliminación de la incubadora pueden resultar en el desarrollo subóptima y tejido enfermo. Imágenes de la misma región en el mismo plano focal y en la misma orientación en cada punto de tiempo es extremadamente difícil. Mediante el uso de un sistema automatizado dentro de una incubadora, es posible mantener saludabletejido, para recoger imágenes en más puntos de tiempo y para garantizar que la misma área es capturada en cada fotograma. En los últimos años se han desarrollado varias incubadoras de tejido microscopio integrados, estos han sido útiles no sólo en la práctica clínica 9, sino también en células madre y la investigación del cáncer 10,11.
Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo a largo plazo de explantes cocleares embrionarias de ratón. Utilizamos un sistema de microscopía automatizada dentro de un incubador de CO2 estándar que tiene la capacidad de capturar imágenes de múltiples muestras en los puntos de tiempo establecidos. El sistema consta de un microscopio invertido conjunto dentro de una incubadora. Las muestras se colocan en una tarima giratoria que permite obtener imágenes de múltiples muestras en cada punto de tiempo. La iluminación, la captura de imágenes, y la rotación de la tarima están controlados por un sistema automatizado operado a través de software Metamorph. Al establecer una rutina de imágenes utilizando el software de funcionamiento podemos establecer un experimento para funcionar durante un máximo de two semanas, con mínima intervención humana. En este ejemplo usamos tanto de campo claro y fluorescencia para mostrar el crecimiento a gran escala y la reordenación de la cóclea, y en concreto, la región prosensorial. En este experimento, cochleae será disecado de ratones reportero EGFP Sox2 en el día embrionario E13. Se establecerá cultivos in vitro y luego fotografiada durante cinco días.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay varios puntos técnicos a tener en cuenta cuando se establecen las culturas y en la creación del microscopio de lapso de tiempo para que la imagen a largo plazo.
Utilizamos matriz de membrana basal como sustrato para el cultivo de explantes cocleares, pero el sustrato debe corresponder al tipo de células. Por ejemplo, para cultivos neuronales de la imagen, puede ser mejor para proporcionar un revestimiento fibronectina. La temperatura de incubación y la composición de gas también de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
¡Gracias a Willy Sun para la asistencia técnica y el Dr. Kris Gellynck por sus valiosos comentarios y tres revisores anónimos por sus consejos constructivos. Este trabajo fue financiado por la Iniciativa de Regeneración Audiencia Sunnybrook
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle media | Gibco | 12430 | Multiple brands manufacture this | http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/classical-media/dmem.html |
| Basement membrane extract | Corning | 354230 | Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers. http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29 |
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| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
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| HEPES | Gibco | 5630080 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
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| 100 x N2 supplement | Gibco | 17502-048 | Multiple brands manufacture this http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&resultPage=1&results PerPage=15&autocomplete= |
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| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | Multiple brands manufacture this http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en®ion=CA |
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| Hank's balanced salt solution | Gibco | 14170161 | Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use. http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s |
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| Fine Forceps | Fine Science tools | 11254-20 | Size number 5 http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&CategoryId=29 |
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| Curette | Fine Science Tools | 10080-05 | size 1 mm http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&CategoryId=118 |
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| Insect Pins | Fine Science Tools | 26001-35 | Must be stainless Steel http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124 |
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| 50 mm plastic dishes | Corning/Falcon | 351006 | Multiple brands manufacture this | |
| charcoal | Sigma Aldrich | 05105-250G | Multiple brands manufacture similar items http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en®ion=CA |
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| 184 silicone elastomer | Dow/Corning | SYLGARD® 184 SILICONE ELASTOMER KIT | Dishes are home made several weeks in advance. Silicone elastomer can be from any supplier.http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291 | |
| Glass bottom dishes | MatTek | P35G-0-10-C | The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system. 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL. http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&cPath= 1_4_15&products_id=2 |
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| Stereomicroscope | Zeiss | 495101-9804-000 | Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html |
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| Cold Light Source | Zeiss | 000000-1063-182 | Multiple brands manufacture similar items http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html |
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| Fluorescent Stereomicroscope | Leica microsystems | Contact Leica microsystems | Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/ |
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| Incubator Microscope +imaging software | Olympus | Contact Olympus | Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software. http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&c=0 |
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| Clean bench | Thermo Scientific | 51029701 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html |
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| CO2 incubator | Thermo Scientific | 3310 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html |
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| Laminar Flow hood | Thermo Scientific | 51026651 | Multiple brands manufacture similar items http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html |
Riferimenti
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