Preneoplastic सेल प्रगति और सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत का जल्द से जल्द घटनाओं का अध्ययन समझते हैं और कैंसर के इलाज के लिए निर्णायक है। यहाँ हम सशर्त उपकला कोशिका परिवर्तनों और HRAS G12V zebrafish लार्वा में त्वचा कोशिकाओं को व्यक्त करने के साथ सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत के बाद रहते इमेजिंग के लिए प्रेरित करने के लिए एक विधि का वर्णन।
Here we describe a method to conditionally induce epithelial cell transformation by the use of the 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) inducible KalTA4-ERT2/UAS expression system1 in zebrafish larvae, and the subsequent live imaging of innate immune cell interaction with HRASG12V expressing skin cells. The KalTA4-ERT2/UAS system is both inducible and reversible which allows us to induce cell transformation with precise temporal/spatial resolution in vivo. This provides us with a unique opportunity to live image how individual preneoplastic cells interact with host tissues as soon as they emerge, then follow their progression as well as regression. Recent studies in zebrafish larvae have shown a trophic function of innate immunity in the earliest stages of tumorigenesis2,3. Our inducible system would allow us to live image the onset of cellular transformation and the subsequent host response, which may lead to important insights on the underlying mechanisms for the regulation of oncogenic trophic inflammatory responses. We also discuss how one might adapt our protocol to achieve temporal and spatial control of ectopic gene expression in any tissue of interest.
एक अन्यथा सामान्य उपकला चादर के भीतर एक preneoplastic सेल संतान की अतिवृद्धि दृढ़ता से अपने microenvironment के साथ एक बातचीत पर निर्भर करता है। अपने मेजबान ऊतक के साथ बातचीत के एक preneoplastic सेल आगे एक पूर्ण विकसित कैंसर में विकसित करने के लिए एक प्रतिरूप आला स्थापित करने में सक्षम है या नहीं की प्रमुख निर्धारक होने की संभावना है। विकास में इसके महत्व के बावजूद, कैंसर प्रगति के इस प्रारंभिक चरण विवो में, सबसे अधिक इस्तेमाल किया मॉडल प्रणाली में दुर्गम है।
zebrafish, देनियो rerio, क्योंकि विकास के दौरान इसकी पारदर्शिता, पानी में घुलनशील दवाओं के लिए आनुवंशिक हेरफेर के लिए संभावना है, और पहुंच के रहते इमेजिंग के अध्ययन के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित मॉडल जीव है। उपकला कोशिकाओं को बदलने के लिए overexpressing, मानव ओंकोजीन HRAS G12V एक लार्वा zebrafish मॉडल का उपयोग हाल के अध्ययनों से, मेजबान सेल विशेष एच 2 ओ 2 का नेतृत्व करने में, संकेतों व्युत्पन्न पता चला है किसहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं की भर्ती। दिलचस्प बात यह है की भर्ती की प्रतिरक्षा कोशिकाओं, न्यूट्रोफिल और मैक्रोफेज, preneoplastic सेल प्रसार 2,3 के समर्थन में एक पौष्टिकता भूमिका है दिखाया गया।
ट्यूमर दीक्षा और प्रगति के प्रारंभिक घटनाओं के रूप में अच्छी तरह से एक भड़काऊ प्रतिक्रिया के योगदान को समझने के क्रम में, एक के बाद जल्द से जल्द समय बिंदु से इन घटनाओं छवि करने में सक्षम होने की जरूरत है। इसलिए यह एक लौकिक और ऊतक विशिष्ट ढंग से सेल परिवर्तनों को नियंत्रित करने के लिए आवश्यक है। हम सफलतापूर्वक सशर्त त्वचा विशिष्ट प्रमोटर केरातिन 4 (krt4) के नियंत्रण के तहत मानव ओंकोजीन HRAS G12V व्यक्त करने के लिए ड्रोसोफिला 4 से अनुकूलित किया गया है कि Gal4 / यूएएस प्रणाली 5 का उपयोग। ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक अर्थात् Gal4, KalTA4 6 का संशोधित संस्करण, नदी के ऊपर सक्रिय अनुक्रम का नियंत्रण (यूएएस के तहत HRAS G12V की अभिव्यक्ति में सक्षम बनाता है)। सशर्त ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने के लिए, KalTA4 विशेष रूप से चार-Hydroxytamoxifen बांधता है जो मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर α की उत्परिवर्ती ligand बाध्यकारी डोमेन (ईआर टी 2) 7 के लिए जुड़े हुए किया गया है (4-OHT) 1। 4-OHT के अभाव में ईआर टी 2 गर्मी झटका प्रोटीन द्वारा कोशिका द्रव्य में ही है। 4-OHT पर ब्याज 8 के जीन से नियंत्रित यूएएस के KalTA4-ईआर टी 2 के परमाणु स्थानान्तरण और बाद के सक्रियण की इजाजत दी, प्रोटीन को अलग कर देना गर्मी सदमे बाध्यकारी (चित्रा 1C, ख)। इस अभिव्यक्ति प्रणाली 4-OHT की उपस्थिति पर निर्भर करता है, ब्याज की एक जीन की KalTA4 नियंत्रित अभिव्यक्ति प्रतिवर्ती है। एक अपरिवर्तनीय पुनर्संयोजन घटना की ओर जाता है जो रचनात्मक-ईआर टी 2 / Lox प्रणाली, के विपरीत, KalTA4-ईआर टी 2 से ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण के शामिल होने के अलावा या 4 OHT को हटाने के द्वारा प्रतिवर्ती है।
निम्नलिखित प्रोटोकॉल allo zebrafish लार्वा में त्वचा कोशिकाओं के एक सशर्त परिवर्तन और फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति द्वारा सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बातचीत के बाद में एक निगरानी था। 13 – इस प्रोटोकॉल में कार्यरत बुनियादी तरीके zebrafish समुदाय 9 के भीतर कुछ आमतौर पर इस्तेमाल तकनीक के समान हैं।
पीढ़ी और साथ में ट्रांसजेनिक निर्माणों के microinjection साथ ट्रांसजेनिक लाइनों के combinatory उपयोग केवल एक मोज़ेक ढंग से एकल कक्षों को बदलने के लिए एक क्षणिक दृष्टिकोण में सक्षम बनाता है। भ्रूण और लार्वा zebrafish त्वचा की ऑक्सीजन पारगम्यता दिनों घंटे से उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी द्वारा समय व्यतीत रहते इमेजिंग अध्ययन के लिए संभावना को जन्म देती है। इसके अलावा, पानी में घुलनशील दवाओं के लिए अपनी पहुंच भविष्य यंत्रवत अध्ययन और कैंसर के विकास के प्रारंभिक चरणों को बेहतर ढंग से समझने के लिए ले जा सकता है कि इन विवो में सेल जैविक घटनाओं की निगरानी की अनुमति देगा।
_content "> इस प्रोटोकॉल एक मोज़ेक ढंग से, zebrafish लार्वा में ब्याज की किसी भी ऊतक में सशर्त जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक भी त्वचा के अलावा अन्य छवि गहरे ऊतकों जीने के लिए सेटिंग माइक्रोस्कोप का अनुकूलन कर सकते हैं।Embryogenesis और लार्वा विकास के दौरान, भ्रूण zebrafish त्वचा, दो उपकला परतों से बना है सतही परत बुलाया periderm और अंतर्निहित तहखाने झिल्ली 19 से जुड़े होते हैं कि बेसल केरेटिनकोशिकाओं की एक परत (चित्रा 1C, एक)। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल सशर्त zebrafish लार्वा की सतही त्वचा की परत में preneoplastic सेल परिवर्तन के लिए प्रेरित करने के लिए एक सरल विधि का वर्णन करता है, और जीने इमेजिंग द्वारा सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ बाद में बातचीत के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। हमारे प्रोटोकॉल में बुनियादी तरीके अच्छी तरह से स्थापित zebrafish तकनीक 9 पालन – 13, और हमारे प्रोटोकॉल आसानी से अनुकूलित और संशोधित किया जा सकता है।
यहां इस्तेमाल krt4 प्रमोटर 5 (चित्रा 1C, ख) सबसे बाहरी त्वचा की परत में विशेष रूप से KalTA4-ईआर टी 2 अभिव्यक्ति ड्राइव। हालांकि, मॉड्यूलर Multisite गेटवेkrt4 उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया रणनीति, क्लोनिंग: KalTA4-ईआर टी 2 का निर्माण (चित्रा -1, क), एक एकल क्लोनिंग कदम में KalTA4-ईआर टी 2 के सामने हित के किसी भी प्रमोटर क्लोन करने के लिए संभावना प्रदान करता है। इस के साथ साथ प्रस्तुत विधि का एक रूपांतर embryogenesis और लार्वा चरणों के दौरान सबसे अधिक ऊतकों के लिए इसलिए संभव है। प्रमोटर दृश्यों की उपलब्धता इसके द्वारा सीमित कारक है। इसके अलावा, एक यूएएस के पीछे क्लोन ब्याज के लगभग किसी भी जीन सशर्त स्थानिक और अस्थायी नियंत्रित KalTA4-ईआर टी 2 अभिव्यक्ति का उपयोग करके विभिन्न विकास के चरणों में overexpressed जा सकता है। इसलिए, हमारे प्रोटोकॉल एक मोज़ेक ढंग से, zebrafish लार्वा में ब्याज की किसी भी ऊतक में सशर्त जीन अभिव्यक्ति प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक भी जिगर या अग्न्याशय के रूप में ऐसी छवि गहरे ऊतकों जीने के लिए सेटिंग माइक्रोस्कोप का अनुकूलन कर सकते हैं।
हम प्रोटोकॉल वह इस्तेमाल कर एक आवेदन का वर्णन किया हैइसी तरह, एक, भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के नियमन का अध्ययन करने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य सूजन modulators के overexpress कर सकते हैं कर रहे हैं एक बड़ी आसानी से लाइव छवि न्युट्रोफिल और एक उम्मीदवार भड़काऊ न्यूनाधिक की अभिव्यक्ति में शामिल करने और गिरफ्तारी के बाद बृहतभक्षककोशिका व्यवहार में बदलाव कर सकते हैं। इसके अलावा, अनुकूलित प्रोटोकॉल भी ऊतक morphogenesis और अंग गठन और के विभिन्न चरणों के दौरान सेल आंदोलन और व्यवहार में बदलाव का पता लगाने के लिए चाहते हैं जो उन लोगों के लिए फायदेमंद होगा, आखिर लाइव छवि अन्य विशिष्ट सेल प्रजातियों के साथ सहज प्रतिरक्षा सेल बातचीत की बातचीत को निशाना बनाया जा सकता है inducible KalTA4-ईआर टी 2 / यूएएस अभिव्यक्ति प्रणाली द्वारा।
हम zebrafish Tol2kit 20 से pDestTol2CG वेक्टर इस्तेमाल किया – एक cmlc2 जिसमें 23: EGFP देहात कैसेट (चित्रा -1, क) एक एसई के रूप में हरी फ्लोरोसेंट सकारात्मक दिल से भ्रूण के बाद चयन की अनुमति देता हैF0 स्क्रीनिंग प्रक्रिया को सरल है कि रूपांतर मार्कर 20। जीनोम में ब्याज की transposon flanked जीन की एक स्थिर प्रविष्टि transposase mRNA के साथ मिलकर प्लास्मिड डीएनए के सह-इंजेक्शन से मदद की है। microinjection के लिए प्लास्मिड डीएनए की तैयारी और transposase mRNA के मानक प्रोटोकॉल निम्नानुसार है। हालांकि, जीनोम में निर्माण के लिए एक सफल एकीकरण Tol2 आधारित स्थानांतरण 14 पर निर्भर करता है। यह विशेष रूप से ध्यान RNases और DNases द्वारा संदूषण और degradations से बचने के लिए बाँझ शर्तों के तहत बर्फ पर काम करने के लिए भुगतान किया जाना है पर प्रकाश डाला गया। एक सेल चरण भ्रूण में microinjection zebrafish 9,10 में लाभ और समारोह के अध्ययन के नुकसान के लिए एक मजबूत और अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एक अच्छी तरह से प्रशिक्षित व्यक्ति को आसानी से एक घंटा में 1,000 से अधिक भ्रूण की जर्दी में इंजेक्षन कर सकते हैं, blastodisc (चित्रा 1 ए, तारांकन) में इंजेक्शन और अधिक अनुभव और प्रशिक्षण की आवश्यकता है। इस प्रक्रिया के दौरान महत्वपूर्ण मैंसुई की हैंडलिंग है। सुई क्षति के बिना सेल घुसना करने के लिए बहुत पतली हो गया है और इसलिए केवल इसकी बहुत नोक पर टूट जाना है। यह नियमित रूप से नियंत्रित करने और प्रत्येक भ्रूण में एक समान इंजेक्शन गारंटी करने के लिए इंजेक्शन के दौरान ड्रॉप आकार को मापने के लिए महत्वपूर्ण है। ध्यान से सुई भ्रूण बारी बारी से करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, संभाला। इस बार blastodisc और इष्टतम पैठ कोण खोजने की जरूरत है।
लगभग निश्चित रूप से इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल किया डीएनए और transposase mRNA की एकाग्रता अभिव्यक्ति दक्षता को प्रभावित करती है। अधिक मात्रा transgene व्यक्त कोशिकाओं का एक बढ़ा अनुपात के लिए, लेकिन डीएनए (> 50 एनजी / μl) की उच्च सांद्रता के साथ नेतृत्व और भी इंजेक्शन भ्रूण के बीच विषाक्त प्रभाव के लिए संभावित उठता है mRNA के (> 100 एनजी / μl) transposase कर सकते हैं। हम प्लास्मिड डीएनए के 50 पीजी और इंजेक्शन EMB प्रति शाही सेना के 100 पीजी से मेल खाती है, जो 10 एनजी / μl डीएनए और 20 एनजी इंजेक्शन के लिए / μl transposase mRNA के, के उपयोग के पक्ष मेंRyo। इन सांद्रता के साथ इंजेक्शन भ्रूण की 100% एकल कक्ष में इंजेक्शन क्षमता पर निर्भर करता है, चार-OHT प्रेरण के बाद, सामान्य रूप से विकसित करने, और 40-70% के बीच शो EGFP-HRAS G12V अभिव्यक्ति है। सकारात्मक भ्रूण के बीच हम आम तौर पर 1-10 क्लोन है कि लगभग 30%, 10-50 क्लोन और 50 से अधिक क्लोन होने के 30% है कि 40% लगता है। कारण हमारे अनुसंधान के उद्देश्य के लिए, हम EGFP-HRAS G12V व्यक्त कम क्लोन के साथ भ्रूण के उपयोग के पक्ष। हम अपने क्षणिक प्रयोगों के लिए 10-50 क्लोन के साथ भ्रूण का चयन करें। ट्रांसजेनिक संस्थापक मछली की पीढ़ी के लिए, हम केवल EGFP सकारात्मक कार्डियक मार्कर और उनके epidermis में EGFP-HRAS G12V सकारात्मक क्लोन की एक बड़ी संख्या के साथ दोनों भ्रूण का चयन करने की सलाह देते हैं।
प्रकाश 24 से अवगत कराया जब (जेड) -4-Hydroxytamoxifen एक सीआईएस-ट्रांस (ईज़ी) interconversion आए। यह सीआईएस isomer (ई) ने अपने ट्रांस समकक्ष 25,26 से 100x कम विरोधी estrogenic है कि पाया गया था। Exposurप्रकाश के लिए ई इसलिए टाला जा सकता है। इथेनॉल में भंग 4-OHT स्टॉक समाधान के लिए एक लंबे समय अवधि में अंधेरे में -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है। हम इनक्यूबेटर और परिवहन के भीतर लक्ष्य जीन प्रेरण के दौरान प्रकाश से पेट्री डिश की रक्षा के लिए एक बॉक्स का उपयोग करें। इमेजिंग के क्षेत्र बहुत छोटा है और पराबैंगनी प्रकाश में चार-OHT के संपर्क में है हालांकि अब समय अवधि से अधिक इमेजिंग अधिकतम अभिव्यक्ति के स्तर को बनाए रखने की सिफारिश की है, जबकि एक न्यूनतम, प्रेरण समाधान की एक निरंतर आदान-प्रदान करने के लिए हर दो घंटे कम हो जाता है। 4-OHT प्रभावी रूप से इसलिए यह बहुत तेजी से जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित कर सकते हैं, जरायु और zebrafish embryogenesis दौरान सबसे बाहरी त्वचा की परतों के माध्यम से permeabilizes। हम आसानी से शामिल करने के दो घंटे के बाद EGFP उत्सर्जन निरीक्षण कर सकते हैं और यह लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति का पहला लक्षण उपचार 8 के तीन घंटे के बाद एक घंटा और पठार के बाद देखा जा सकता है कि सूचना दी गई है। मतभेद हमारे अध्ययन में इस्तेमाल विभिन्न प्रमोटर की वजह से हो सकता है। गया जनसंपर्क किया गया है के रूप मेंeviously 4-OHT उपचार निर्भर 8,27 खुराक है कि सूचना दी, हम अपने क्षणिक दृष्टिकोण में मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए 5 माइक्रोन के उच्चतम रिपोर्ट एकाग्रता का उपयोग करने के लिए चुना है। इस transgene ले जाने के सभी कोशिकाओं लक्ष्य जीन की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करेगा कि गारंटी चाहिए।
यह वजह से कई और यादृच्छिक जीनोम प्रविष्टि की घटनाओं की संभावना के लिए यहाँ प्रस्तुत क्षणिक दृष्टिकोण बदलती अभिव्यक्ति के स्तर को ले जा सकता है कि ध्यान में रखा जाना है। इसके अलावा, टीजी (यूएएस: EGFP-HRAS G12V) की Tol2 ट्रांसजेनिक पृष्ठभूमि में transposase mRNA की उपयोग io006 जीन मुंह बंद करने या विघटन में परिणाम सकता है कि यूएएस transgene की संभावित प्रतिस्थापन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक क्षणिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है लेकिन, जैसा कि इंजेक्शन के बाद भ्रूण की पूर्व चयन अनिवार्य है। कई प्रयोगशालाओं यूएएस दृश्यों इसलिए में, ट्रांसजेनिक वंश में खामोश हो जाते हैं कि मिल गया हैpTol2-krt4 jecting: KalTA4-ईआर टी 2; cmlc2: EGFP टीजी (यूएएस: EGFP-HRAS G12V) में निर्माण io006 भ्रूण एक यूएएस टीजी (krt4 में निर्माण इंजेक्शन लगाने के रूप में कुशल नहीं हो सकता: KalTA4-ईआर टी 2; cmlc2: GFP ) भ्रूण। स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन टीजी का उपयोग समय-खुराक निर्भर 4-OHT जीन सक्रियण के पर / बंद कैनेटीक्स का एक सटीक निगरानी की अनुमति देगा io006 (krt4: KalTA4-ईआर टी 2) टीजी (EGFP-HRAS G12V यूएएस) के साथ पार ।
लार्वा के बढ़ते दौरान एक महत्वपूर्ण कदम एलएमपी agarose में और कवर गिलास (चित्रा 1 बी) पर हस्तांतरण है। या तो गर्मी के झटके से मछली को नुकसान पहुँचाने या जेल की सख्त बिना preselected लार्वा का एक सुरक्षित हस्तांतरण और अभिविन्यास की अनुमति देता है कि तरल एलएमपी agarose के तापमान के लिए एक छोटी समय सीमा ही नहीं है। लार्वा बाद सूक्ष्म analy के लिए काम दूरी को कम करने के लिए कांच कवर पर सीधे केंद्रित किया जाना चाहिएबहन। इस माइक्रोस्कोपी के दौरान एक सीमित कारक हो सकता है के रूप में उपयुक्त उद्देश्यों के चुनाव अनिवार्य है। एक बार घुड़सवार, लार्वा दिनों घंटे से बनाए रखा जा सकता है।
इस के साथ साथ प्रस्तुत मॉडल प्रणाली का सोपाधिकता transgene की चार-OHT सक्रियण द्वारा दोहराया परिवर्तन के लिए अनुमति देता है। (चित्रा -1, बी) अभिव्यक्ति प्रणाली 4-OHT की उपस्थिति पर निर्भर करता है और इसलिए ब्याज की एक जीन की KalTA4 नियंत्रित अभिव्यक्ति प्रतिवर्ती है। एक अपरिवर्तनीय जीनोमिक पुनर्संयोजन घटना 28 की सुविधा है, जो रचनात्मक-ईआर टी 2 / Lox प्रणाली, के विपरीत, KalTA4-ईआर टी 2 / यूएएस सक्रिय किया जा सकता है और इसके अलावा या 4 OHT के हटाने पर निष्क्रिय और दोहराया शामिल करने के लिए इस क्षमता का एक फायदा है Cre-ईआर टी 2 / Lox व्यवस्था पर तकनीक। प्रयोग सप्ताह के दिनों से लंबे समय तक किया जाना है हालांकि, अगर चार-OHT की लगातार स्तरों के लिए आवश्यकता के लिए एक सीमा है।
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a Wellcome Trust Sir Henry Dale Fellowship to Y. F. 100104/Z/12/Z.
We would like to thank Dr. Carl Tucker and the team of the fish facility at the Queen’s Medical Research Institute, University of Edinburgh. We like to thank Michael Millar of the immunohistology and imaging facility of the MRC Centre for Reproductive Medicine, University of Edinburgh for support.
We thank Prof. Dr. Matthias Hammerschmidt and Dr. Heiko Loehr of the Institute of Developmental Biology, University of Cologne for providing the p5E-krt4 entry vector. We also would like to thank Dr. Dirk Sieger of the Centre of Neuroregeneration, Univerity of Edinburgh for providing the pDestTol2CG destination vector.
Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
(Z)-4-Hydroxytamoxifen | Sigma Aldrich | H7904 | dilute in ethanol and store in the dark at -20°C |
20x Objective | Zeiss | 20x/0,5 Ph2 ∞/0,17 | |
40x Objective | Zeiss | 40x/1,2W Korr ∞/0,14-0,18 | |
63x Objective | Zeiss | 63x/1.4 Oil Ph3 ∞/0,17 | |
BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
Confocal Microscope | Zeiss | LSM 510 META | |
Cover glass | VWR | 631-0171 | Diameter 25mm |
Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPSV | |
Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma Aldrich | MKBL4135V | |
Flaming/Brown P-97 Micropipette Puller | Sutter Instruments Co. | P-97 | Program: heat 530, pull 200, velocity 80 and time 150 |
Fluorescent stereoscope | Leica | M205 FA | |
Kwik-Fill Brosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Microinjection mold TU-1 | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
Microloader tip | Eppendorf | 930001007 | |
Microscope | Zeiss | Axiovert 200 | |
mMESSAGE mMACHINE Kit | Ambion | AM1348 | |
Nuclease-free water | Invitrogen | AM9937 | |
Pneumatic pico pump | World Precision Instruments | PV820 | |
Pneumatic pico pump | Warner Instruments | PLI-90A | |
pTol2-krt4:KalTA4-ERT2;cmlc2:eGFP | Dr. Thomas Ramezani/Yi Feng Lab/The University of Edinburgh | ||
QIAprep Spin Miniprep Kit | Quiagen | 27106 | |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran | Sigma Aldrich | R8881 | 10mg/μl in water |
Stereoscope | Leica | M80 | |
Tg(lysC:dsRed2)nz50Tg | BMC developmental biology 7, 42, doi:10.1186/1471-213X-7-42 (2007) | ||
Tg(UAS:eGFP-HRASG12V)io006 | PloS one 5 (12), e15170, doi:10.1371/journal.pone.0015170 (2010) | ||
Tricaine/MS-222 | Sigma Aldrich | A5040 | |
UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500-100 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
UltraPure Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-031 | 25:24:1, v/v |