Rilevamento di<em> In Situ</em> Complessi proteina-proteina del<em> Drosophila</em> Larvale neuromuscolare Junction Utilizzando prossimità legatura Assay

Summary

Questo protocollo dimostra come Proximity legatura test può essere utilizzato per rilevare in situ interazioni proteina-proteina in Drosophila larvale neuromuscolare giunzione. Con questa tecnica, dischi grandi e Hu-li Shao tai sono presenti per formare un complesso in corrispondenza della zona postsinaptico, un'associazione precedentemente identificato mediante co-immunoprecipitazione.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Drosophila dischi di grandi dimensioni (Dlg) è un membro conservato della guanilato famiglia chinasi associata alla membrana di ponteggi proteine ​​che aiutano a orchestrare l'assemblaggio di grandi complessi proteici in siti specifici della membrana plasmatica. Originariamente identificato come una proteina soppressore del tumore, Dlg serve come un importante determinante di epiteliale ^1,2,3 apicobasal polarità. Dlg serve anche come un importante modulo di ponteggio a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ) dei motoneuroni glutamatergici durante lo sviluppo larvale ^4. Dlg svolge ruoli diversi al larvale NMJ, e la sua pleiotropismo si basa sulla sua capacità di associare con più proteine ^​​5,6. Una di queste proteine ​​è Hu-li tai shao (Hts), un omologo alle adducins mammiferi che sono stati descritti principalmente per quanto riguarda i loro ruoli nella regolazione della actina-spettrina citoscheletro ^7. È stato precedentemente dimostrato che Dlg e Hts possono formare un complesso con l'altro sulla base in vitro </em> esperimenti di co-immunoprecipitazione coinvolgono tutta adulti di mosca lisati ^8. Una carenza di questi risultati, tuttavia, è che non indicano dove Questo forme complesse. Con l'uso di immunoistochimica, le distribuzioni di Dlg e HTS vengono osservate per sovrapporsi alla membrana postsinaptica del NMJs larvali, ma sono in un complesso in questa regione ^8? Come recentemente dimostrato e dettagliato ulteriormente qui, di prossimità legatura Assay (PLA) è utilizzato per cercare un in situ associazione tra Dlg e Hts specificamente al larvale NMJ ^27.

PLA è una relativamente nuova tecnica utilizzata principalmente in cellule e tessuti cultura in grado di rilevare le interazioni proteina-proteina in situ ^9. In questo saggio, gli anticorpi primari contro le due proteine ​​di interesse vengono rilevati con un paio di anticorpi secondari specie-specifici, definito sonde PLA, che sono coniugati ad oligonucleotidi (Figura 1A, B). Se le due proteines sono in stretta vicinanza l'uno all'altro (cioè entro poche decine di nanometri), la distanza tra le sonde PLA allegate può essere colmato attraverso ibridazione di oligonucleotidi due connettori aggiuntivi (Figura 1C). In questa conformazione, le estremità libere delle oligonucleotidi connettore sono abbastanza vicino per fare contatto con l'altro, e una molecola di DNA circolare chiuso possono essere formati su di legatura in situ (Figura 1D). La molecola di DNA circolare serve come modello per in situ cerchio di rotolamento di amplificazione, che è innescato da uno degli oligonucleotidi coniugati alle sonde PLA (Figura 1E). Sequenze all'interno amplificato, prodotto DNA concatemeric risultante possono poi essere visualizzati con, sonde oligonucleotidiche complementari fluorescenza marcata (Figura 1F). Poiché il DNA amplificato rimane attaccato ad una delle sonde PLA, la localizzazione subcellulare della proteina-proteina interazione withina tessuto può essere prontamente accertata.

Diversi metodi sono comunemente usati per rilevare le interazioni proteina-proteina anche di tecniche in vitro, come co-immunoprecipitazione, pull-down test e lievito di screening doppio ibrido, e di tecniche vivo come il trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) e bimolecolari complementazione fluorescenza ( BiFC). Una trappola delle tecniche in vitro è che essi non identificano in cui l'interazione è endogeno in corso, mentre le tecniche vivo il citate di coinvolgono l'espressione artificiale di proteine ​​di fusione che non può riflettere il comportamento nativo dei loro omologhi endogeni. Uno dei principali vantaggi di PLA è che è in grado di determinare all'interno di un tessuto la localizzazione subcellulare di interattori proteici endogeni che sono in stretta vicinanza l'uno all'altro e probabilmente formano un complesso, con il grado di vicinanza necessaria per generare un segnale è paragonabile alla FRET e BiFC. PLA può rilevare interazioni con alta specificità e sensibilità a causa dell'accoppiamento del riconoscimento anticorpale e amplificazione del DNA. Così, il dosaggio può generare segnali luminosi discreti, in forma di puncta che rivelano la posizione esatta dell'interazione. Inoltre, gli antigeni difficilmente visibili possono essere rilevati. Infine, PLA è una tecnica relativamente semplice da eseguire, e non richiede una procedura di immunoistochimica standard per completare. Pertanto, PLA offre un vantaggio tecnico rispetto agli altri saggi di interazione proteina-proteina che sono spesso afflitto con tempi lunghi di preparazione e ampie risoluzione dei problemi.

Questo protocollo illustra come PLA può essere applicato al Drosophila larvale NMJ al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogena in situ. Qui, PLA viene eseguita su preparazioni muscolari parete corpo larvali dove Dlg e Hts sono mostrati di esistere davvero in un complesso in zona post-sinaptica di NMJs. PLA non è stata precedentemente utilizzata per studiare la larvale NMJ, e ci sono al momento solo una manciata di articoli pubblicati che hanno utilizzato questo test nel tessuto Drosophila. Si spera che ulteriore esposizione del PLA per la comunità Drosophila si tradurrà in un maggiore ricorso come uno strumento aggiuntivo per integrare altri, più comunemente usati proteina-proteina saggi di interazione.

Protocol

1. Preparazione parete Corpo NOTA: Preparazione di terzo stadio larvale pareti corpo (per lo studio delle NMJs che innervano i muscoli della parete corpo) è stata eseguita come precedentemente descritto in Brent et al 10, o Ramachandran e Budnik 11,12, ma con alcune modifiche.. Dissezione Sollevare scorte mosca e croci a 25 ° C per 5-6 giorni usando procedure standard 13. Scegli strisciando terzo instar larve …

Representative Results

In wild-type terzo stadio larvale NMJs, Dlg è prevalentemente trova a livello della membrana post-sinaptica di tipo I boutons glutamatergiche, con livelli di immunoreattività Dlg essere più pronunciato in tipo IB boutons di tipo è boutons (figura 3A) 4. Hts è presente in tutto il muscolo, ma si concentra in zona post-sinaptica con Hts livelli immunoreattività appare uguale in entrambi di tipo I boutons, ed è anche trovato presinapticamente (figura 3A ') 8,17.<…

Discussion

Questo rapporto dimostra come PLA può essere applicata alla Drosophila larvale NMJ. Il test viene eseguito su preparazioni muscolari parete corpo larvali al fine di rilevare le interazioni proteina-proteina endogeni presenti al NMJ. Con questa tecnica, Dlg e HTS vengono mostrati per essere in stretta vicinanza l'uno all'altro, e pertanto esistere in un complesso, in particolare in corrispondenza della zona ²⁷ postsinaptico. A sostegno di questo risultato, un precedente studio ha fornito prov…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040