Détection de<em> In Situ</em> complexes protéine-protéine à la<em> Drosophila</em> Larvaire jonction neuromusculaire Utilisation Proximité ligature Assay

Summary

Ce protocole montre comment Proximité Ligation Assay peut être utilisé pour détecter des interactions protéine-protéine in situ à la jonction des larves de Drosophila neuromusculaire. Avec cette technique, disques grande et Hu-li shao de tai sont présentés pour former un complexe dans la région post-synaptique, une association préalablement identifiés par co-immunoprécipitation.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Drosophila disques large (DLG) est un élément conservé de la famille guanylate kinase associée à la membrane d'un échafaudage de protéines qui aident à orchestrer l'ensemble de grands complexes de protéines à des sites spécifiques de la membrane plasmique. Initialement identifié comme une protéine suppresseur de tumeur, Dlg sert un déterminant important de l'épithélium ^1,2,3 apicobasal de polarité. Dlg sert également un module d'échafaudage majeur à la jonction neuromusculaire (JNM) des neurones moteurs glutamatergiques cours du développement larvaire ^4. Dlg joue divers rôles à la JNM des larves, et son pléiotropisme repose sur sa capacité à associer à de multiples protéines ^5,6. Une telle protéine est Hu-li tai shao (Hts), un homologue aux adducins mammifères qui ont été décrites principalement en ce qui concerne leurs rôles dans la régulation du cytosquelette d'actine-spectrine ^7. Il a été montré précédemment que la DLG et Hts peuvent former un complexe avec l'autre sur la base in vitro </em> expériences de co-immunoprécipitation impliquant toute mouche adulte lysats ^8. Un inconvénient de ces résultats, cependant, ce est qu'ils ne indiquent pas où cela formes complexes. Avec l'utilisation de l'immunohistochimie, les distributions de la DLG et sont observés Hts à se chevaucher sur la membrane post-synaptique de la JNM des larves, mais elles sont dans un complexe dans cette région ^8? Comme l'a récemment illustré et détaillé plus loin ici, Proximité ligature Assay (PLA) est utilisé pour rechercher une association entre Dlg situ et Hts en particulier au stade larvaire NMJ ^27.

PLA est une technique relativement nouvelle utilisée principalement dans la culture de cellules et de tissus qui permet de détecter les interactions protéine-protéine in situ ^neuf. Dans ce dosage, les anticorps primaires contre les deux protéines d'intérêt sont détectés avec une paire d'anticorps secondaire spécifique à l'espèce, appelées sondes PLA, qui sont conjugués à des oligonucleotides (Figure 1A, B). Si les deux protéiness sont à proximité étroite les uns des autres (ce est à dire au bout de quelques dizaines de nanomètres), la distance entre les sondes attachées PLA peut être comblé par l'hybridation de deux oligonucléotides connecteurs complémentaires (figure 1C). Dans cette conformation, les extrémités libres des oligonucléotides connecteurs sont suffisamment proches pour entrer en contact avec l'autre, et une molécule d'ADN circulaire fermé peuvent être formées sur la ligature en situ (Figure 1D). La molécule d'ADN circulaire sert de matrice in situ pour l'amplification par cercle roulant, qui est amorcée par l'un des oligonucléotides conjugués à des sondes de l'APL (Figure 1E). Les séquences au sein de la amplifiée, un produit d'ADN concatémère résultant peuvent ensuite être visualisées, avec des sondes oligonucléotidiques complémentaires marquées par fluorescence (Figure 1F). Étant donné que l'ADN amplifié reste attaché à l'une des sondes de l'APL, la localisation subcellulaire de la protéine-protéine interaction withitissus na peut être facilement établi.

Plusieurs méthodes sont couramment utilisées pour détecter les interactions protéine-protéine, y compris des techniques in vitro telles que la co-immunoprécipitation, pull-down des essais et de la levure Double hybride, et dans les techniques in vivo telles que le transfert Förster Resonance Energy (FRET) et bimoléculaire complémentation de fluorescence ( BiFC). Un écueil des techniques in vitro, ce est qu'ils ne identifient pas où l'interaction est endogène produit, tandis que les techniques in vivo l'susmentionnés impliquent dans l'expression artificielle de protéines de fusion qui peuvent ne pas refléter le comportement natif de leurs homologues endogènes. Un avantage majeur de PLA est qu'il est capable de déterminer au sein d'un tissu de la localisation subcellulaire des interacteurs protéiques endogènes qui sont à proximité étroite les uns aux autres et susceptibles formant un complexe, avec le degré de proximité nécessaire pour produire un signal comparable à FRET et BiFC. PLA peut détecter des interactions avec une spécificité élevée et une sensibilité due au couplage de la reconnaissance d'anticorps et l'amplification d'ADN. Ainsi, le dosage peut générer des signaux lumineux discrets, sous la forme de points lacrymaux qui révèlent la position exacte de l'interaction. En outre, les antigènes à peine visibles peuvent être détectés. Enfin, le PLA est une technique relativement simple à réaliser, et il ne prend pas plus d'une procédure standard pour compléter immunohistochimique. Par conséquent, PLA offre un avantage technique sur d'autres tests d'interaction protéine-protéine qui sont souvent en proie à des temps de préparation long et vaste dépannage.

Ce protocole montre comment PLA peut être appliquée à la Drosophile larvaire JNM dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes in situ. Ici, le PLA est effectuée sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps où Dlg et Hts sont présentées d'exister en effet dans un complexe dans la région post-synaptique du NMJs. PLA n'a pas déjà été utilisé pour étudier la JNM des larves, et il ya à l'heure actuelle seule une poignée d'articles publiés qui ont utilisé cette technique dans le tissu drosophile. Il est à espérer que la poursuite de l'exposition de PLA à la communauté Drosophila entraînera dans son utilisation accrue comme un outil supplémentaire pour compléter d'autres, les plus couramment utilisés essais d'interaction protéine-protéine.

Protocol

1. Préparation du corps mur REMARQUE: Préparation du troisième stade larvaire parois du corps (par étude des NMJs qui innervent les muscles de la paroi du corps) a été réalisée comme décrit précédemment dans Brent et al dix, ou Ramachandran et Budnik 11,12, mais avec quelques modifications.. Dissection Augmenter les stocks et les croix mouche à 25 ° C pendant cinq à six jours en utilisant des procédures standard …

Representative Results

Dans de type sauvage troisième stade larvaire NMJs, Dlg est principalement trouvé à la membrane postsynaptique de type I boutons glutamatergiques, avec des niveaux d'immunoréactivité Dlg étant plus marquée dans le type Ib boutons que le type est boutons (figure 3A) 4. Hts est présent tout au long du muscle, mais se concentre dans la région post-synaptique avec Hts niveaux d'immunoréactivité apparaissant égale dans les deux boutons de type I, et se retrouve également prés…

Discussion

Ce rapport montre comment PLA peut être appliqué à la drosophile larves NMJ. Le dosage est réalisé sur des larves préparations de muscle de la paroi du corps dans le but de détecter les interactions protéine-protéine endogènes présentes à la jonction neuromusculaire. Avec cette technique, Dlg Hts et sont indiqués pour être à proximité immédiate de l'autre, et ainsi exister dans un complexe, en particulier dans la région post-synaptique ^27. À l'appui de ce résultat, une ét…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040