Detecção de<em> In Situ</em> Complexos proteína-proteína no<em> Drosophila</em> Larval Junção Neuromuscular Usando Proximity Ligation Assay

Summary

Este protocolo demonstra como Ensaio de Proximidade A ligadura pode ser utilizada para detectar em interacções proteína-proteína in situ na junção neuromuscular, de larvas de Drosophila. Com esta técnica, os discos grande e Hu-li Shao tai são apresentados para formar um complexo na região pós-sináptica, uma associação previamente identificado por meio de co-imunoprecipitação.

Abstract

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.

Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Introduction

Discos de Drosophila grande (Dlg) é um membro conservada da guanilato-quinase associada à membrana da família de proteínas de andaimes que ajudam a orquestrar a montagem de grandes complexos de proteínas em sítios específicos da membrana plasmática. Originalmente identificado como uma proteína supressora de tumor, Dlg serve como um importante determinante da epitelial ^1,2,3 apicobasal polaridade. Dlg também serve como um importante módulo de andaime na junção neuromuscular (JNM) dos neurônios motores glutamatérgicos durante o desenvolvimento larval ^4. Dlg desempenha diversos papéis na JNM larval, e a sua pleiotropismo depende da sua capacidade de se associar com várias proteínas de ^5,6. Uma dessas proteínas é Hu-li tai Shao (HTS), um homólogo às adducins mamíferos que foram descritos principalmente no que diz respeito às suas funções na regulação da actina-spectrin citoesqueleto ^7. Foi previamente mostrado que Dlg e Hts pode formar um complexo com os outros com base em testes in vitro </em> experimentos co-imunoprecipitação envolvendo toda mosca adulta lisados ^​​8. Uma desvantagem destes resultados, no entanto, é que elas não indicam onde este formas complexas. Com a utilização de imuno-histoquímica, as distribuições de Dlg e Hts são observados a sobrepor-se na membrana pós-sináptica da NMJs larvas, mas são eles em um complexo na região ^8? Como mostrado recentemente e detalhado mais aqui, Proximity Ligation Assay (PLA) é usado para procurar um em associação situ entre Dlg e Hts especificamente no larval NMJ ^27.

PLA é uma técnica relativamente nova usado principalmente em cultura de células e de tecidos que podem detectar interacções proteína-proteína in situ ^9. Neste ensaio, os anticorpos primários contra as duas proteínas de interesse são detectados com um par de anticorpos secundários específicos da espécie, denominados sondas de PLA, que são conjugados com oligonucleótidos (Figura 1A, B). Se as duas proteínass estão em estreita proximidade uns dos outros (isto é, dentro de poucas dezenas de nanómetros), a distância entre as sondas de PLA podem ser ligados em ponte através de hibridação de dois oligonucleótidos de conectores adicionais (Figura 1C). Neste conformação, as extremidades livres dos oligonucleótidos do conector está perto o suficiente para entrar em contacto uns com os outros, e uma molécula de ADN circular, fechada pode ser formada a partir de ligadura situ (Figura 1D). A molécula de ADN circular, serve como molde para a amplificação in situ círculo rolante, o qual é preparado por um dos oligonucleótidos conjugados com as sondas de PLA (Figura 1E). Sequências dentro do amplificado, produto de ADN concatemeric resultante pode então ser visualizado com marcada com fluorescência, as sondas de oligonucleótidos complementares (Figura 1F). Uma vez que o ADN amplificado permanece ligado a uma das sondas de PLA, a localização subcelular da interacção proteína-proteína withind tecido pode ser facilmente determinada.

Vários métodos são comumente usados ​​para detectar interacções proteína-proteína, incluindo técnicas in vitro tais como a co-imunoprecipitação, ensaios de pull-down e levedura de rastreio de dois híbridos, e em técnicas in vivo, tais como transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) e Bimolecular Complementação de fluorescência ( BiFC). Um problema das técnicas in vitro é que eles não identificam onde a interacção ocorre endogenamente, enquanto o acima mencionados nas técnicas in vivo envolvem a expressão artificial de proteínas de fusão que pode não reflectir o comportamento nativo dos seus homólogos endógenos. Uma grande vantagem de PLA é que ele é capaz de determinar dentro de um tecido a localização subcelular de proteínas de interactores endógenos que estão em estreita proximidade uns dos outros e provável que formam um complexo, com o grau de proximidade necessária para gerar um sinal a ser comparáveis ​​aos FRET e BiFC. PLA podem detectar interacções com elevada especificidade e sensibilidade devido ao acoplamento de reconhecimento do anticorpo e a amplificação de ADN. Assim, o ensaio pode gerar sinais luminosos discretas, em forma de pontos lacrimais que indicam a posição exacta da interacção. Além disso, os antigénios dificilmente visíveis pode ser detectada. Finalmente, PLA é uma técnica relativamente simples de executar, e já não tem do que um procedimento padrão imuno-histoquímico para ser concluído. Portanto, PLA fornece uma vantagem técnica sobre outros ensaios de interação proteína-proteína que muitas vezes são atormentados com tempos de preparação longa e extensa solução de problemas.

Este protocolo demonstra como PLA pode ser aplicado para a Drosophila larval JNM para a finalidade de detecção de interacções proteína-proteína endógenos, in situ. Aqui, PLA é realizada em preparações de músculos da parede do corpo larval onde Dlg e Hts são mostrados para realmente existem em um complexo na região pós-sináptica da NMJs. PLA não tenha sido previamente utilizado para estudar a NMJ larval, e existem, actualmente, apenas um punhado de artigos publicados que utilizaram este ensaio no tecido Drosophila. Espera-se que uma maior exposição do PLA para a comunidade Drosophila resultará em aumento da sua utilização como uma ferramenta adicional para complementar outras, mais comumente utilizados ensaios de interação proteína-proteína.

Protocol

1. Corpo de parede Preparação NOTA: Preparação do terceiro estádio larvar paredes do corpo (para estudo de NMJs que enervam os músculos da parede corporal) foi realizada como previamente descrito em Brent et al 10, ou Ramachandran e Budnik 11,12, mas com algumas modificações.. Dissecação Elevar existências mosca e cruzes, a 25 ° C durante cinco a seis dias, utilizando 13 procedimentos standard. Escol…

Representative Results

Em selvagens terceiro estádio NMJs larvais, Dlg é predominantemente encontrado na membrana pós-sináptica de tipo I boutons glutamatérgicos, com níveis de imunorreatividade Dlg sendo mais pronunciada na boutons tipo Ib que o tipo é boutons (Figura 3A) 4. Hts está presente em todo o músculo, mas concentra-se na região pós-sináptica com Hts níveis imunorreatividade aparecendo igual em ambos os tipos I boutons, e também é encontrada pré-sináptico (Figura 3A ')</strong…

Discussion

Este relatório demonstra como PLA pode ser aplicado para a Drosophila larval JNM. O ensaio é realizado em preparações de músculo da parede do corpo de larvas para a finalidade de detecção de interacções proteína-proteína endógenos presentes na NMJ. Com esta técnica, Dlg e Hts mostram-se em estreita proximidade uns dos outros, e assim existir em um complexo, especialmente na região pós-sináptica ^27. Em apoio a esse resultado, um estudo anterior tenha apresentado provas de sua associaç…

Materials

Name of Material/Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Forceps (fine #5)	Almedic	A10-704
Sylgard Disc	World Precision Instruments	SYLG184	Mix elastomer base and curing agent in a 10:1 ratio. Set for 30 min. Pour into a mold (e.g. use a 12-well cell culture plate). Let cure for at least 24 hr. Adhere to the lid of a 60x15mm petri dish lid when dissecting.
Minutien Pins (0.0125 mm tip diameter)	Fine Science Tools	26002-10
Microdissection Scissors (ultra fine)	Fine Science Tools	15200-00
Platform Slides			Glue two 22x22mm coverslips onto a microscope slide with clear nail polish, leaving a <20mm gap in between for sample mounting.
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
hts01103	Bloomington Drosophila Stock Center	10989	Stock was re-balanced over a GFP balancer so that homozygous mutants can be selected based on the absence of GFP signal.
1x PBS (Phosphate Buffered Saline): 3mM NaH2PO4, 7mM Na2HPO4, 130mM NaCl, pH 7.0			NaH2PO4 (Caledon Laboratories – 8180-1), Na2HPO4 (Caledon – 8120-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Bouin's Solution	Sigma-Aldrich	HT10132
4% PFA (Paraformaldehyde): 4% PFA in 1x PBS			PFA (Anachemia Science – 66194-300). See doi:10.1101/pdb.rec9959 Cold Spring Harb Protoc 2006 for instructions on how to make the solution.
1x PBT (Phosphate Buffered Saline with Triton): 1x PBS with 0.01% Triton			Triton X-100 (Sigma-Aldrich – T8787)
1% BSA (Bovine Serum Albumin): 1% BSA in 1x PBT			BSA (Bioshop Canada – ALB001). Store at 4 °C.
mouse anti-Dlg (Discs large)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4F3	Use at a 1:10 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-HtsM (Hu-li tai shao)			Provided by Dr. Lynn Cooley (Yale University). Use at a 1:250 dilution in 1% BSA.
rabbit anti-Pak (p21-activated kinase)			Provided by Dr. Nicholas Harden (Simon Fraser University). Use at a 1:500 dilution in 1% BSA.
mouse anti-Wg (Wingless)	Developmental Studies Hybridoma Bank	4D4	Use at a 1:5 dilution in 1% BSA.
goat anti-Hrp (Horseradish peroxidase)	Jackson              ImmunoResearch	123-065-021	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
FITC-conjugated donkey anti-goat	Jackson             ImmunoResearch	705-095-003	Use at a 1:200 dilution in 1% BSA.
Duolink In Situ PLA Probe anti-mouse MINUS	Sigma-Aldrich	DUO92004
Duolink In Situ PLA Probe anti-rabbit PLUS	Sigma-Aldrich	DUO92002
Duolink In Situ Detection Reagents Red	Sigma-Aldrich	DUO92008
1x Wash Buffer A: 0.01M Tris, 0.15M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.4	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1), Tween 20 (Fisher Scientific – BP337)
1x Wash Buffer B: 0.2M Tris, 0.1M NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
0.01x Wash Buffer B: 2mM Tris, 1mM NaCl, pH 7.5	Sigma-Aldrich	DUO82049	Tris (Caledon Laboratories – 8980-1), NaCl (Caledon – 7560-1)
Duolink In Situ Mounting Medium with DAPI	Sigma-Aldrich	DUO82040