Gene targeting methodologies can be used to generate transgenic mice with knockout, knock-in and tagged alleles. Here, we describe an improved method of recombineering in E. coli, that we term ‘subcloning plus insertion’, which can be used to generate custom gene targeting vectors rapidly.
Gene targeting refers to the precise modification of a genetic locus using homologous recombination. The generation of novel cell lines and transgenic mouse models using this method necessitates the construction of a ‘targeting’ vector, which contains homologous DNA sequences to the target gene, and has for many years been a limiting step in the process. Vector construction can be performed in vivo di Escherichia coli cells using homologous recombination mediated by phage recombinases using a technique termed recombineering. Recombineering is the preferred technique to subclone the long homology sequences (>4kb) and various targeting elements including selection markers that are required to mediate efficient allelic exchange between a targeting vector and its cognate genomic locus. Typical recombineering protocols follow an iterative scheme of step-wise integration of the targeting elements and require intermediate purification and transformation steps. Here, we present a novel recombineering methodology of vector assembly using a multiplex approach. Plasmid gap repair is performed by the simultaneous capture of genomic sequence from mouse Bacterial Artificial Chromosome libraries and the insertion of dual bacterial and mammalian selection markers. This subcloning plus insertion method is highly efficient and yields a majority of correct recombinants. We present data for the construction of different types of conditional gene knockout, or knock-in, vectors and BAC reporter vectors that have been constructed using this method. SPI vector construction greatly extends the repertoire of the recombineering toolbox and provides a simple, rapid and cost-effective method of constructing these highly complex vectors.
Le développement de technologies géniques ciblant a permis la construction de lignées cellulaires et des modèles de souris pour étudier différents systèmes biologiques 1-3. Une première étape clé dans la modification d'une séquence génomique est la conception et la construction d'un gène vecteur de ciblage 4. Des vecteurs de ciblage sont des constructions plasmidiques qui portent l'allèle d'intérêt contenant les modifications désirées (s) flanqué par un marqueur de sélection (par exemple, la néomycine), et de longues régions génomiques nécessaires pour une recombinaison homologue efficace dans des cellules de mammifères 5. Modification génétique précise est obtenue par l'introduction du vecteur de ciblage dans souches embryonnaires (ES) des cellules 6 ou des cellules somatiques 7, dans lequel la recombinaison homologue entre les tronçons identiques de la séquence d'ADN sur le vecteur de ciblage et les résultats de locus génomiques dans le transfert de la modification envisagée au génome par conversion génique 8. Cette modified cellules ES peuvent être injectées dans des blastocystes de souris pour produire une descendance (chimères) qui peut ensuite transmettre ces allèles modifiés via la lignée germinale 9. Une voie alternative pour produire des souris transgéniques implique la micro-injection d'un vecteur d'expression de gènes dans des zygotes unicellulaires de souris, ce qui conduit à l'intégration aléatoire du vecteur dans le génome de la souris 10. Les méthodes traditionnelles de construction du vecteur sont appuyés sur conventionnelle "couper-coller" clonage en utilisant des enzymes de restriction et les ligases d'ADN à cloner les différents marqueur de sélection et des fragments génomiques dans un squelette du vecteur. Cependant, un facteur limitant inhérente de clonage traditionnel est le positionnement et le choix des sites de restriction, en particulier avec de plus longues séquences d'ADN. Ceci nécessite souvent plusieurs étapes de sous-clonage et introduit également des séquences d'ADN étranger dans le vecteur, ce qui conduit souvent à une efficacité inférieure de ciblage de gène.
Recombineering (eng recombinogèneineering) est une technologie d'ingénierie d'ADN qui surmonte ces limitations en utilisant une recombinaison homologue (HR) à médiation par des protéines de recombinaison phage dans E. cellules de E. coli 11,12. Etant donné que ne importe quelle région d'une séquence homologue peut servir de substrat de recombineering, les contraintes de disponibilité de sites de restriction sont enlevés. De grandes séquences d'ADN peuvent être modifiés de façon transparente directement in vivo, préservant ainsi aussi leur intégrité structurelle 13. Recombineering est très efficace avec des homologies courtes (50 pb) 14 et donc bras d'homologie (HA) peuvent être facilement incorporés dans des séquences d'oligo synthétiques. Dans une expérience de recombineering typique, un oligo ou un fragment d'ADN double brin (ADNdb) contenant HA est électroporation dans E. recombineering compétente cellules de E. coli contenant la cible située soit sur le chromosome ou sur un plasmide 15. Le potentiel de recombinaison est conféré par l'expression inductible de la rec-Rougeombinaison protéines de phage 16,17 ou les protéines RecET du prophage rac 18. Le exonucléase Rouge / RecE convertit ADNdb linéaires à un ADN simple brin (ADNsb) intermédiaire, qui est ensuite lié par son partenaire, Rouge / RecT, un seul brin protéines de recuit (SSAP) 19. Le recuit d'un long ou un court ADNsb oligo à sa séquence cible complémentaire se produit sur la mèche de ralentissement de la fourche de réplication et conduit à l'incorporation de la séquence au niveau du site cible. Retard brin ssADN recombinaison est la base de la grande efficacité de recombineering et peut être décrit par la 'beta' modèle de recombinaison 20,21.
Un workflow de recombineering typique pour construire un vecteur de ciblage de gène implique l'une des deux voies suivantes. Une voie consiste à sous-clonage de la région génomique désirée à partir d'un clone BAC de la souris dans un plasmide, suivie par l'insertion séquentielle des sites de recombinaison LoxP, un marqueur de sélection <sjusqu'à> 22 etc., ou la voie alternative consiste à cibler le locus génomique de BAC avec les différents éléments de vecteur de ciblage par plusieurs tours de recombineering 10,23 puis sous-clonage du locus modifié dans un plasmide par écart de réparation clonage 24,25. Variations sur ce thème ont été utilisés dans différents pipelines à haut débit recombineering dans le cadre de programmes de production à grande de souris 26,27. Toutefois, ces procédures impliquent les étapes longues et complexes, nécessitent l'utilisation de vecteurs spécialisés et E. coli souches (par exemple, des cellules exprimant Cre) et d'utiliser une ou plusieurs étapes intermédiaires de purification de l'ADN vecteur et re-transformation (tableau 1). Sous-clonage insertion plus (SPI) est une nouvelle technique de recombineering qui combine beta recombinaison et la réparation écart clonage dans un processus unique (Figure 1). SPI assemblage de vecteur est simple, rapide et flexible et offre une amélioration significative sur recombi normeingé- approches (tableau 1). Ici, nous démontrons la facilité et l'utilité de l'aide SPI pour différentes applications de construction du vecteur avec un accent particulier sur la construction de conceptions de vecteur non-standard et difficiles. Les cas de tests comprenaient la construction d'un vecteur reporter de Knockin fluorescent, une expression de protéine marquée vecteur Knockin double, un vecteur rapporteur fluorescent de BAC et un vecteur de knock-out conditionnel. Ceux-ci ont examiné diverses à l'exigence de localiser un récepteur de surface cellulaire, la purification d'un complexe de protéine nucléaire ou ablatent conditionnelle l'expression d'un gène.
Construction de lignes de cellules souches embryonnaires et les modèles de souris a historiquement impliqués ciblage de gène en utilisant des constructions plasmidiques qui contenaient l'allèle modifié 4. Cependant, la construction de ces vecteurs de ciblage génique complexes se est avérée être un obstacle important à la production rapide de ces modèles. Le développement de stratégies de construction du vecteur de recombineering base a permis l'amélioration des dessins vectoriels et assemblage de vecteur plus efficace. Néanmoins, les protocoles de recombineering actuels impliquent toujours plusieurs étapes, exigent la purification de plasmide intermédiaire et utilisent différentes souches bactériennes. Sous-clonage insertion plus offre une nouvelle approche pour la construction du vecteur qui peut être effectuée dans une épreuve d'électroporation dans la souche BAC hôte de résident. L'utilité de SPI dans le ciblage génique a été testée ici dans une variété d'applications de construction de vecteur. Dans tous les cas examinés ici, SPI se est avérée efficace et le plasmide recombinant a été produit correcte.Dans la majorité des cas, les multiples cassettes différentes ont été correctement inséré dans le vecteur de ciblage. Les grandes cassettes et des vecteurs d'ADN sont facilement logés dans le protocole SPI et ont démontré la souplesse de ce système.
SPI repose sur l'utilisation de séquences longues d'homologie et phosphorothioate (PTO) protection des cassettes d'ADN linéaire. modification de force confère une protection contre exonucléases à l'ADN linéaire 20,21 et la longue HA augmente l'efficacité de recombinaison pour permettre le multiplexage. Cependant, la synthèse des séquences plus longues oligo augmente les chances d'accumulation des erreurs en particulier des suppressions. Des mutations dans le oligo peuvent être particulièrement préjudiciable si elles couvrent des régions codantes de protéines. séquençage de l'ADN à travers le HA et couvrant la pleine longueur de la cassette insérée est fortement recommandé d'éliminer clones avec des altérations de séquence. Utilisation d'un système d'ADN polymerase haute fidélité est également recommandé d'éviter l'introduction d'uny erreurs de PCR. La longueur et la composition de l'HA du plasmide de sous-clonage est plus critique par rapport à celle de la cassette d'introduction (données non présentées). Pour les applications particulièrement sensibles comme la construction de vecteurs Knockin, où des mutations dans les régions d'exon ne sont pas tolérés, l'HA de la cassette d'insertion peut être raccourcie (50-120 pb) pour éviter les problèmes associés aux longs oligos. La cassette d'insertion peut également être laissée non modifié ou sous forme de phosphorothioate double (où la connaissance de la direction de la replication ne est pas disponible). Mais multiplexage dans ces cas nécessite encore longtemps protégé HA plasmides sous-clonage. Une mise en garde de cette stratégie particulière est l'abaissement de l'efficacité multiplexage qui peuvent avoir une incidence sur le clonage à des loci SPI différente.
La longueur de la cassette d'insertion et le plasmide de sous-clonage est un autre paramètre important dans le clonage SPI. Molécules d'ADN plus grands électroporer moins efficace et l'effet est cumulatif, compte tenu de la reexigence voulant introduire toutes les cassettes dans la même cellule (données non présentées). Le multiplexage est plus efficace avec des petites cassettes d'insertion. Fragments d'ADN de plus de 3 kb placer aussi une limite sur le traitement des ssADN médiation Rouge, qui est la plus efficace jusqu'à 3 kb 30. cassettes d'insertion de plus de 3 kb sont à double résection et recombinent moins efficacement par une voie indépendante de 20 bêta. Par conséquent, le dépistage de colonies suffisante pour identifier le clone correct devient important dans ces cas. Une durée plus longue de la recombinaison après électroporation augmente également les chances de guérison du clone correct à des exercices difficiles SPI. Jusqu'à quatre petites cassettes (<1,5 kb) peuvent être insérés en même temps que le processus SPI, bien que l'efficacité de multiplexage diminue avec chaque cassette additionnelle (données non présentées). Toutefois, cela reflète le résultat d'une expérience SPI optimale et il est conseillé de considérer les limites de multiplexage lors de l'utilisation de nombreuses grandes cassettes. </p>
Le développement d'outils d'édition du génome comme cluster répétitions palindromiques courts régulièrement espacées (CRISPR) système de endonucléase -cas9 a permis la création de nouvelles modifications du génome et a conduit à plus efficace l'ingénierie des génomes 36. Cependant, ces nouvelles technologies ont complété ciblage génique vecteurs plutôt que de les supplanter. Il est envisagé que le système CRISPR-cas pourrait remplacer sélection antibiotique et affiner le protocole recombineering multiplex.
The authors have nothing to disclose.
T.R.R conceived the project, designed and performed experiments and prepared the manuscript. E.J.K and S.E.M performed experiments. All authors contributed intellectually to the final manuscript. This work was funded by a University of Leicester Innovation Fellowship to SEM and by a UK Medical Research Council (MRC) Senior Research Fellowship to S.M.C (MR/J009202/1). DNA sequencing was performed by Protein and Nucleic Acid Laboratories (PNACL), Centre for Core Biotechnology Services, University of Leicester. We wish to thank A. Francis Stewart for providing the Rox and Dre plasmids. pL451 and pL452 plasmids were obtained from National Cancer Institute (NCI), Frederick, USA.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Antibiotics except Zeocin | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | Ampicillin, A9518-5G; Chloramphenicol , C1919-5G; Blasticidin, 15205-25MG; Gentamicin, G1264-50MG; Hygromycin, H3274-50MG; Kanamycin,: K1876-1G; Tetracycline hydrochloride, T7660-5G; Trimethoprim, 92131-1G |
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Zeocin | Invivogen: | ant-zn-1 | Zeocin is also available from Life technologies/Fisher |
C57BL/6 BAC clones | CHORI: https://bacpac.chori.org/ | RPCI-23 or RPCI-24 BAC libraries | 129/Sv BAC clones can be obtained from Invivogen or Life technologies/Fisher |
KOD hotstart DNA polymerase system | Millipore: https://www.merckmillipore.com | 71086-3 | |
L-Arabinose | Sigma: http://www.sigmaaldrich.com | A3256-25G | |
Long oligos | IDT: https://www.idtdna.com; Gene link: https://www.genelink.com | IDT Ultramers or Gene Link long oligos | PTO and Phosphosphate available as custom modifications. PAGE purification strongly recommended for long oligos. |
MinElute PCR purification kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 28004 | Minimum elution PCR purifications kits are preferred. |
QIAPrep Spin Mini Prep kit | Qiagen: http://www.qiagen.com | 27104 | Silica column or similar matrix kits are preferred. |
Restriction enzymes | NEB: https://www.neb.com | DpnI: R0176L | See NEB website for a list of RE. |