Descriviamo un protocollo per la derivazione di cellule staminali pluripotenti umane indotte prive di fattori riprogrammate e caratterizzate su base lentivirale e la conversione in condizioni cliniche putative.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Derivazione e caratterizzazione di un free-Transgene umana indotta pluripotenti staminali Cell Line e Conversione in definite condizioni clinico-grade
In questo articolo
Sommario
Abstract
Umane pluripotenti indotte (cellule staminali hiPSCs) possono essere generati con le metodologie di riprogrammazione basata lentivirali-. Tuttavia, tracce di geni potenzialmente oncogeni rimanenti nelle regioni attivamente trascritti del genoma, limitano il loro potenziale per l'uso in applicazioni terapeutiche umani 1. Inoltre, antigeni non umani derivanti dalla riprogrammazione di cellule staminali o di differenziazione in derivati terapeuticamente rilevanti escludono questi hiPSCs vengano utilizzati in un contesto clinico umano 2. In questo video, vi presentiamo una procedura per la riprogrammazione e l'analisi hiPSCs senza fattore gratuitamente transgeni esogeni. Questi hiPSCs poi possono essere analizzati per alterazioni di espressione genica nel introne specifica l'lentivirus. Questa analisi può essere condotta utilizzando sensibile reazione a catena della polimerasi quantitativa (PCR), che ha un vantaggio rispetto meno sensibili tecniche precedentemente utilizzato per rilevare le differenze di espressione genica 3. La conversione completa inbuone prassi di fabbricazione clinica-grade (GMP) condizioni, permette di rilevanza clinica umana. Il nostro protocollo offre un altro metodo, a condizione che i criteri esenti attuali espandere e comprendono caratterizzati derivati basati hiPSC senza fattore di applicazioni, ad terapeutiche umane derivanti hiPSCs GMP-grade, che dovrebbero eliminare qualsiasi rischio di immunogenicità a causa di antigeni non-umani. Questo protocollo è ampiamente applicabile per lentivirali riprogrammato cellule di qualsiasi tipo e fornisce un metodo riproducibile per la conversione di cellule riprogrammate in condizioni di GMP-grade.
Introduzione
Le cellule umane adulte hanno dimostrato di essere in grado di subire rimodellamento e riprogrammazione epigenetica, come risultato dell'espressione lentivirale di quattro fattori di trascrizione chiave4,5. Un importante progresso nel campo della riprogrammazione è stato l'uso di una singola cassetta di cellule staminali lentivirali essociabili (STEMCCA), che ospitava tutti e quattro i fattori di trascrizione di riprogrammazione che consentivano un preciso rapporto stechiometrico di espressione proteica6. Inoltre, quando trasdotta in una specifica molteplicità di intervalli di infezione, STEMCCA può portare a eventi di integrazione genomica preva....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Questo metodo è stato utilizzato nella ricerca riportata nel Awe et al 10..
1. Riprogrammazione umano adulto Dermal fibroblasti con STEMCCA
- Fibroblasti dermici Thaw adulti umani (HUFS), di passaggio a 4 o inferiore, in un bagno d'acqua a 37 ° per 2 minuti, avendo cura di non immergere la parte superiore del flaconcino con l'acqua.
- Posizionare la poltiglia 1 ml di fibroblasti umani in una fiala conica 15 ml e posizionare lentamente 4 ml di supporti HUF standard preriscaldata a 37 ° C, in un modo goccia a goccia, per diluire le dimetil solfossido (DMSO) e risospendere le cellule. <....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Vi presentiamo un protocollo per derivare clinico-grade hiPSCs senza fattore utilizzando l'approccio basato riprogrammazione-lentivirali STEMCCA. La figura 1A mostra un quadro rappresentativo di tre diverse linee di pre-asportato hiPSC, dopo la riprogrammazione con l'approccio STEMCCA su uno strato di MEF. Il vantaggio principale del metodo riprogrammazione STEMCCA risiede nel successo riprogrammazione coerente ottenuto da più scienziati, in diversi gruppi di ricerca e posizioni. Figura 1B
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Descriviamo una metodologia di derivazione hiPSCs senza fattore e renderli clinicamente rilevante convertendo queste cellule in condizioni GMP-grade per la differenziazione delle cellule a valle in future terapie umane. Sebbene questo protocollo è ampiamente applicabile ad una varietà di tipi cellulari, abbiamo scelto di riprogrammare fibroblasti dermici umani, a causa della facilità di estrazione dal paziente e la loro applicabilità alle terapie umane personalizzati. Una volta che le limitazioni sono state sanate, per .......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
James A. Byrne (JAB) e Agustin Vega-Crespo ricevono finanziamenti per la ricerca da Fibrocell Science, Inc. JAB è un consulente scientifico per Fibrocell Science, Inc. Nessun altro autore ha interessi concorrenti da rivelare.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Patrick C. Lee, Cyril Ramathal, e Saravanan Karumbayaram (SK) per la loro assistenza nell'esecuzione degli esperimenti di derivazione e caratterizzazione delle iPSC; Aaron Cooper per l'esecuzione degli esperimenti di analisi delle iPSC; Vittorio Sebastiano e Renee A. Reijo Pera per aver diretto gli sforzi iniziali di riprogrammazione; SK, William E. Lowry, Jerome A. Zack e Donald B. Kohn per aver diretto l'istituzione delle strutture GMP dell'UCLA che consentono la conversione e la caratterizzazione di iPSC di grado clinico; Gustavo Mostoslavsky per averci fornito il vettore di riprogrammazione policistronica STEMCCA. Questo lavoro si basa su una ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Terreni e reagenti | |||
| DMEM/F12 (terreni basali) | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 11330057 | |
| Siero fetale bovino | Invitrogen | 16000044 | |
| Terreno essenziale minimo (MEM) aminoacidi non essenziali (NEAA), 100x | Invitrogen | 11140050 | |
| Glutamax, 100x | Invitrogen | 35050-061 | |
| PenStrep, penicillina-streptomicina, 100x | Invitrogen | 15140-122 | Scongelare a 4 gradi; C, aliquotare e conservare a &meno; 20 ° C |
| Siero di ricambio knockout | Invitrogen | 10828028 | scongelare a 4 gradi C, aliquotare e conservare a &meno; 20 ° C |
| Tripsina/EDTA, 0,5% | Invitrogen | 15400-054 | Diluire il brodo fino allo 0,05% in 1x PBS |
| Fattore di crescita dei fibroblasti di base | GlobalStem (Rockville, MD, USA) | GSR-2001 | Ricostituire a 10 &; g/ml di pasta in albumina sierica bovina allo 0,1% disciolta in 1x PBS e conservare a &meno; 80 gradi C |
| β-mercaptoetanolo | Millipore (Billerica, MA, USA) | ES-007-E | |
| Matrigel (matrice della membrana basale) | BD Biosciences (San Jose, CA, USA) | 356231 | Diluire il flaconcino madre Matrigel con 10 ml di DMEM/F12 mentre è in ghiaccio per una diluizione 1:2. Aliquot e conservare a &meno; 20 °C. |
| CELLstart (Substrato sintetico) | Invitrogen | A1014201 | |
| Stemmolecule Y27632 | Stemgent (Cambridge, MA, USA) | 04-0012-02 | |
| Puromicina | Invitrogen | A1113802 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche (Basilea, Svizzera) | 4707494001 | |
| ProFreeze-CDM Medium/mezzo di congelamento | Lonza (Basilea, Svizzera) | 12-769E | |
| Dimetil solfossido | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) | D8418 | |
| PBS | Invitrogen | 14190-250 | |
| 100 BP DNA Ladder | Invitrogen | 15628019 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain 10.000x | Invitrogen | S33102 | |
| Agarose | Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA, USA) | 161-3101 | |
| Gelatina, da pelle suina | Sigma-Aldrich | G1890-100G | Produrre brodo allo 0,2% in PBS, autoclavare e conservare a temperatura ambiente. |
| mTeSR1 | StemCell Technologies (Vancouver, BC, Canada) | 5850 | Combina l'integratore 5x con il terreno di base, aliquote e conserva a 4 gradi; C per un massimo di 2 settimane. |
| Stemedia NutriStem XF/FF Terreno di coltura | Stelo | 05-100-1A | Scongelare a 4 gradi C O/N, aliquotare e conservare a 4 gradi C per un massimo di 2 settimane. |
| Primocin | InvivoGen (San Diego, CA, USA) | ant-pm-1 | |
| Accutase (reagente di dissociazione) | Invitrogen | A1110501 | |
| Donkey anti-Chicken IgG AlexaFluor 488 | Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, USA) | 703-546-155 | |
| Polybrene/agente di trasfezione | Millipore | TR-1003-G | |
| Plasticware | |||
| 12 pozzetti | VWR (West Chester, PA, USA) | 29442-038 | |
| piastre a 6 pozzetti | VWR | 29442-042 | |
| piastre da 10 cm | Sigma-Aldrich | Z688819 | |
| ago calibro 18 | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA) | 148265D | |
| ago calibro 21 | Fisher Scientific | 14-829-10D | |
| Equipment | |||
| BD LSRII Flow Cytometer | KSystem by Nikon (Tokyo, Giappone) | ||
| BD FACSDiva Versione 6.1.3 Software | BD Biosciences | ||
| Kits | |||
| PureLink Genomic DNA Mini Kit | Invitrogen | K182000 | |
| KAPA HiFi Hotstart ReadyMix PCR Kit | KAPA Biosystems (Wilmington, MA, USA) | KK2601 | |
| Kit di isolamento dell'RNA ad alta purezza | Roche | 11828665001 | |
| Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit | Roche | 4379012001 | |
| Sialix anti-Neu5Gc Basic Pack Kit | Sialix (Newton, MA, USA) | Pack | |
| Media | |||
| Combined media 1 | StemCell Technologies e Stemgent | È costituito da parti uguali di mTeSR1 e Nutristem | |
| Terreni combinati 2 | StemCell Technologies e Stemgent | È costituito da parti uguali di TeSR2 e | |
| Nutristem HUF Media | Dulbecco' s Eagle modificato' s medium/F12 [DMEM/F12] integrato con il 10% di siero fetale bovino, 1x aminoacidi non essenziali, 1x Glutamax e 1x Primocin | ||
| Human Pluripotent Stem Cell Media | DMEM/F12 integrato con il 20% di siero sostitutivo knockout, 1x Glutamax, 1x aminoacidi non essenziali, 1x Primocin, 1x β-mercaptoetanolo e 10 ng/ml di fattore di crescita basico dei fibroblasti. | ||
| DMEM/F12, Dulbecco' s Eagle modificato' s medio/F12; PBS, soluzione salina tamponata con fosfato. |
Riferimenti
- Sommer, C. A., Mostoslavsky, G. The evolving field of induced pluripotency: Recent progress and future challenges. J Cell Physiol. 228, 267-275 (2013).
- Lu, H. F., et al.
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
Esplora altri articoli
