Non invasiva parenchimale, vascolare e metabolica ad alta frequenza ad ultrasuoni e fotoacustico Rat profonda Brain Imaging

Summary

Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo per eseguire ultrasuoni ad alta frequenza non invasivi e imaging fotoacustico su cervello di ratto, per visualizzare in modo efficiente le regioni sottocorticali profonde e i loro modelli vascolari dirigendo i segnali sui forami del cranio naturalmente presenti sul cranio animale.

Abstract

La fotoacustica e gli ultrasuoni ad alta frequenza si distinguono come potenti strumenti per applicazioni neurobiologiche che consentono l'imaging ad alta risoluzione sul sistema nervoso centrale di piccoli animali. Tuttavia, il neuroimaging transdermico e transcranico è spesso influenzato da bassa sensibilità, aberrazioni dell'immagine e perdita di risoluzione spaziale, che richiedono la rimozione del cuoio capelluto o addirittura del cranio prima dell'imaging. Per superare questa sfida, viene presentato un nuovo protocollo per ottenere informazioni significative sull'emodinamica cerebrale mediante imaging fotoacustico e ultrasuoni ad alta frequenza con la pelle e il cranio dell'animale intatti. La procedura si basa sul passaggio di onde ultrasoniche (US) e laser direttamente attraverso le fessure che sono naturalmente presenti sul cranio dell'animale. Giustapponendo il trasduttore di imaging esattamente in corrispondenza di queste aree selezionate in cui il cranio ha uno spessore ridotto o è totalmente assente, è possibile acquisire immagini profonde di alta qualità ed esplorare regioni cerebrali interne che di solito sono difficili da descrivere anatomicamente o funzionalmente senza un approccio invasivo. Applicando questa procedura sperimentale, è possibile raccogliere dati significativi sia in modalità sonica che optoacustica, consentendo di visualizzare l'anatomia parenchimale e vascolare molto al di sotto della superficie della testa. Le caratteristiche profonde del cervello, come le circonvoluzioni parenchimali e le fessure che separano i lobi, erano chiaramente visibili. Inoltre, la configurazione dei vasi sanguigni grandi e piccoli è stata ripresa a diversi millimetri di profondità e sono state raccolte informazioni precise sui flussi sanguigni, sulle velocità dei flussi vascolari e sullo stato chimico dell'emoglobina. Questo repertorio di dati potrebbe essere cruciale in diversi contesti di ricerca, che vanno dagli studi sulle malattie vascolari cerebrali alle tecniche sperimentali che coinvolgono la somministrazione sistemica di sostanze chimiche esogene o altri oggetti dotati di proprietà di miglioramento del contrasto di imaging. In conclusione, grazie al protocollo presentato, le tecniche ecografiche e PA diventano un mezzo attraente e competitivo per le prestazioni non invasive per l'imaging corticale e cerebrale interno, mantenendo un potenziale significativo in molti campi neurologici.

Introduction

Sono necessarie strategie per descrivere minuziosamente le caratteristiche di emodinamica cerebrali nel sistema nervoso centrale di piccoli animali per far avanzare il campo delle neuroscienze ^1-3. La tecnica presentata dimostra come eseguire acustico non invasivo e di imaging fotoacustico sul cervello piccolo animale al fine di esaminare la biologia vascolare, disposizioni e la funzione.

Tecniche di imaging ottico consentono la localizzazione degli eventi legati all'attività neurale ^2,4-5 e contemporaneamente acquisire segnali generati da emoglobina sia negli stati ossigenati e non ossigenato ^6. Tuttavia, a causa dell'assorbimento fotonico e dispersione, imaging ottico puro soffre di scarsa risoluzione spaziale e tissutale limitata profondità di penetrazione ^7-8. Al contrario, l'acustica offrono la possibilità di effettuare l'imaging profondo con risoluzione spaziale spaziale più alta, ma è ostacolato da speckle e limitato contrasto ^9-11. Combinando le caratteristiche della fotonica with ultrasuoni, tecnica fotoacustica migliora sia l'imaging e le potenzialità diagnostiche dei singoli metodi ^12-16.

L'imaging fotoacustico del cervello ha il potenziale per chiarire domande multiple in neurobiologia, tuttavia, la calotta cranica che protegge naturalmente l'encefalo, drammaticamente limita sia la penetrazione nei tessuti ^17-19 fotonica e ultrasuoni. Inoltre, le ossa promuovere dispersione della luce e del suono con conseguente perdita di sensibilità e di immagine aberrazioni ^17-18. Di conseguenza, ultrasuoni cervello e di imaging fotoacustico possono essere facilmente eseguiti su animali neonati prima ossificazione ^20, ma l'anatomia profonda e fisiologia del cervello adulto sono chiaramente accessibili solo dopo craniotomia ^21,22. Purtroppo, l'intervento necessario per la rimozione cranio è tecnicamente difficile ei suoi effetti può essere dannosa per alcuni scopi sperimentali rendendo così difficile per monitorare la progressione della malattia neurale nelstesso animale nel tempo. Pertanto, un metodo non invasivo per immagine profonda biologia cerebrale in piccoli modelli animali è altamente desiderabile. Nella letteratura metodo di fotoni riciclatore ¹⁷ è riportato come un modo per ridurre la perdita cellulare e aumentare la trasmittanza attraverso il cranio intatto, migliorando il segnale fotoacustico a rumore (SNR) e il contrasto del bersaglio.

Il protocollo presentato si propone di fornire un metodo affidabile per acustica cerebrale sottocorticale e di imaging fotoacustico sulla ricerca uso roditori (in particolare sui ratti) senza chirurgia invasiva. La procedura si basa sull'uso di dispositivi di trasduzione portatili per ultrasuoni ad alta frequenza e di imaging fotoacustico. In contrasto con la tecnologia di imaging tomografico ^23, portatile e trasduttori direzionali ²⁴ consentire la selezione di specifiche regioni cranio con spessori ridotti, naturalmente, chiamato fessure o scissures. I principali fessure (forami) presenti sul vertebrato unnimal cranio sono necessarie per individuare i fasci nervosi, serbatoi o altre strutture di raccordo circuiti interni encefalo ad altre parti del corpo. I principali fessure si trovano nelle aperture ossa di diverse dimensioni che possono essere sfruttate come passaggi specifici per ultrasuoni e laser. Tale immagini mirata riduce gli effetti di riflessione delle onde causate da interfacce ossa e aumenta la sensibilità aumentando la profondità di penetrazione delle immagini. In questa prospettiva, il trasduttore di immagini può essere predisposta per essere perpendicolare alle fessure poste sul temporale e sul lato occipitale del cranio (figura 1), al fine di convergere massimo ultrasuoni e raggi fotonici su queste aree. Questo orientamento sia migliora la qualità del segnale e forza il segnale per procedere attraverso un sottile strato osseo rispetto ad altri orientamenti cranici. Pertanto, le onde trasmesse e riflesse subiscono un minor grado di dispersione, consentendo la raccolta di segnali provenienti da intense profondostrati di tessuto. In contrasto con le procedure precedenti, questa impostazione sperimentale richiede testina di rasatura proprio animale, mentre non è necessario un altro intervento chirurgico.

Con la proposta di protocollo, l'imaging viene eseguita a relativamente alta risoluzione spaziale, rivelando sia, strutture anatomiche di riferimento specifico e vasi sanguigni più profonde di quanto lo stato attuale dei metodi d'arte, il tutto mentre la pelle di animale e del cranio rimangono intatti. Immagini coronali e assiali unici possono essere acquisiti sfruttando diverse modalità di acquisizione di immagini ad ultrasuoni (B, Power Doppler, Color Doppler, modalità onda pulsata) in parallelo all'imaging fotoacustica. Un repertorio esteso di parametri può essere estratto da queste immagini, consentendo rappresentazione di parenchimale e vascolare a fianco di un intera collezione di caratteristiche che influenzano le dinamiche di circolazione sanguigna. Questo protocollo può essere utilizzato per immagini caratteristiche di base parenchima corticali in Alta Frequenza modalità Ultrasuoni B modalità, le arterie carotidi basilari e interni (BA e ICA, rispettivamente) che compongono il circolo di Willis, cerebrale media (MCA) e altri dettagli dell'apparato circolatorio. Inoltre, il sangue flusso quantificazione, significa velocità di flusso, la descrizione del movimento direzionale e dati di saturazione di ossigeno può essere raccolto dal corticale a regioni cerebrali profonde.

Questa nuova strategia ha un grande potenziale per una varietà di applicazioni e soddisfa la necessità urgente di procedure affidabili per rappresentare funzioni cerebrali profonde che sono cruciali in diverse patologie. Inoltre, a causa della sua minima invasività, protocollo presentato può abilitare miriade studi di imaging possibili sul sistema nervoso centrale, in particolare quelli che richiedono monitoraggio a lungo termine o coinvolge modelli animali patologici delicati.

Protocol

Esperimenti necessari per sviluppare il protocollo sono stati eseguiti secondo le normative nazionali e sono state approvate dal comitato etico della scienza locale (Comitato di Bioetica di Ateneo), che opera all'interno dell'istituzione dell'Università degli Studi di Torino, Torino, Italia.

1. Preparazione

1. Anestesia
   1. Posizionare l'animale all'interno della camera isoflurano appropriato per anestetizzare esso.
   2. Riempire la camera con O ₂ e mista gas isoflurano per uso veterinario ad una concentrazione di 2,5% in una camera a gas 2 L e attendere per circa 3 minuti per il ratto addormentarsi. Controllare l'effetto di anestesia da un pinch punta.
   3. Una volta che l'anestesia ha effetto, rimuovere il topo e si pesa.
   4. Distribuire uno strato sottile di gel idrosolubili oftalmica sugli occhi dell'animale per proteggerli e per mantenere l'idratazione fisiologica oculare.
   5. Posare il ratto su una ecografia e la stazione di imaging fotoacustico piano di lavoro. Ioordine n per mantenere l'effetto dell'anestesia, rapidamente posizionare il naso all'interno della maschera appropriata fornendo un flusso costante di anestesia (isoflurano 2% -2,5% di ossigeno 1 L / min).
2. Rasatura l'animale
   1. Stendere uno strato uniforme di crema rimozione dei capelli sulla superficie della testa, con attenzione a coprire aree orecchie e il collo circostanti. Lasciare la crema agire per alcuni minuti e delicatamente togliere con una spatola. Softly rimuovere tutti i residui di crema con una spugna bagnata per pulire accuratamente la pelle.
      NOTA: La pelliccia animale intrappola aria che influisce negativamente ultrasuoni acquisizione di immagini basato, quindi deve essere necessariamente rimosso per quanto possibile.
3. Posizionamento l'animale
   1. Disporre l'animale in una posizione di spread-eagle. Monitorare i segni vitali, tramite opportuni sensori vitali parametri sul piano di lavoro (se presenti). Magra le zampe sui sensori dopo l'applicazione di alcune gocce di crema elettrodo per uso professionale.
      NOTA: Durante l'anestesia, affinché i parametri vitali hanno valori come segue: ratto temperatura corporea ≈ 37,5 ° C, battiti cardiaci per minuto (bpm) varia tra 250 e 350 e la frequenza respiratoria è compreso nell'intervallo di 40-80 respiri al minuto .
   2. Infine fissare gli arti con toppa seta artificiale ipoallergenico. Se necessario, spalmare ancora uno strato sottile di gel idrosolubile oftalmica per proteggere gli occhi dell'animale.

2. Acquisizione di immagini dal temporale Point of View

1. Posizionamento l'animale
   1. Mantenendo l'animale in posizione prona, ruotare il corpo leggermente sul lato, con un angolo di inclinazione di circa 45 ° rispetto all'asse del corpo sagittale. Usare piccoli rotoli di garza di cotone, come sta per organizzare correttamente allo smaltimento (Figura 2a).
   2. Sollevare la testa di animale e ruotare leggermente su un lato (Figura 2a). Utilizzare un rullo di cotone come supporto mantenendo l 'inserimento muso beneta nella maschera anestesia.
   3. Inclinare il piano di lavoro con un angolo di circa 30 ° rispetto al piano orizzontale.
   4. Ruotare il trasduttore di imaging con un angolo di circa 30 ° rispetto al piano verticale.
2. Ultrasuoni e fotoacustica acquisizione delle immagini anatomiche e vascolare
   1. Girare la scansione di immagini in, accedere alla modalità B acquisizione delle immagini e impostare correttamente tutti i parametri di acquisizione di immagini a rispettare eventuali requisiti riportati dell'esperimento (Figura 3a).
      NOTA: impostare la frequenza di trasmissione centrale più basso possibile (16 MHz, Figura 3b), in modo da avere la massima profondità di penetrazione possibile per il trasduttore.
   2. Eliminare uno strato uniforme (spessore di circa 1 cm) di acqua ipoallergenico gel trasmissione ultrasuoni solubile sulla testa dell'animale (Figura 2b). Coprire testa trasduttore con un sottile strato di gel stesso e metterlo in contatto con lo strato sulla rat. Utilizzare gel caldo per ridurre al minimo l'ipotermia localizzata.
   3. Inizia acquisizione di immagini in modalità B e regolare la posizione del trasduttore in tempo reale, identificando riferimenti anatomici e centrando la regione di interesse per il punto centrale del monitor. Assicurati di eliminare le bolle d'aria, a qualsiasi livello intrappolato nello strato di gel, in quanto influenzano negativamente l'acquisizione.
   4. Posizionare il trasduttore per allinearlo alla asse virtuale che collega l'orecchio all'occhio (Figura 4a) per ottenere una focalizzazione del fascio ottimale. Acquisire diversi punti di vista del volume cerebrale interna, di orario o rotazione in senso antiorario (figura 4b e c).
   5. Infine fissare il trasduttore su un supporto meccanico per fissare stabilmente la posizione e l'orientamento di sintonizzare in modo fine.
   6. Assicurarsi che la regione cerebrale di interesse localizza a 10 mm di profondità rispetto alla sorgente trasduttore US-LASER per ricevere un pH ottimalesegnale di risposta otoacoustic (Figura 5). Poi posto l'indicatore di US onda focalizzazione esattamente al centro dell'area analizzata.
      NOTA: Durante la ricerca di aree di interesse, evitando l'attivazione dell'opzione porta respirazione, al fine di accelerare la procedura di posizionamento.
   7. Inserisci Modo colore Doppler di visualizzare i vasi sanguigni del cervello interne in modo sensibile alto.
   8. Una volta che il posizionamento è stato impostato in modo appropriato per visualizzare le regioni ricercati, attivare l'opzione porta respirazione per evitare gli effetti indesiderati legati al movimento (Figura 6a).
   9. Scegliere il desiderato set di parametri di acquisizione in Color Doppler Mode (figura 6b) e acquisire immagini in questa modalità per distinguere sangue velocità del flusso e indicazioni, fino a diversi millimetri di profondità di penetrazione.
   10. Entrare in modalità pulsata onda Doppler e acquisire le immagini per rilevare pulsazione del sangue dell'arteria e di distinguere tra le arterie avene nd.
   11. Inserire Modalità Doppler Potenza ed impostare i parametri di acquisizione (Figura 7) per eseguire una quantificazione segnale sulla base del numero di eventi di scattering provocate dal movimento flusso, e quindi valutate differenze nei tassi di flusso.
   12. Entrare in modalità fotoacustico e correttamente perfezionare parametri di acquisizione (Figura 8 bis) per la raccolta dei dati sul contenuto di emoglobina totale di sangue o laurea ossigenazione in una data area. Producendo eccitazione laser su un intero spettro di lunghezza d'onda (da 680 nm a 970 nm, Figura 8b), l'assorbimento di emoglobina totale presente nei diversi stati chimici all'interno di un tessuto può essere quantificato. Eseguendo raccolta segnale su lunghezze d'onda specifiche singole (Figura 8c), è possibile isolare i contributi dei segnali distinti per l'assorbimento di ossigeno e specie pure de-ossi.

3. Imaging dal punto di vista occipitale

1. Posizionamento l'animale
   1. Mantenere l'animale in posizione prona, abbassare la testa di animale e utilizzare piccoli rotoli di garza di cotone come laterale sta per organizzare correttamente allo smaltimento.
   2. Ruotare imaging trasduttore parallelo al piano trasversale della testa di animale (Figura 9).
      NOTA: In questo modo, l'acquisizione sarà centrato attraverso il forame occipitale alla base del cranio. Variando l'angolo di inclinazione dell'orientamento della sonda (Figura 9), sarà possibile acquisire immagini interne dei vasi in viste differenti a seconda dell'inclinazione impostazione.
2. Ultrasuoni e fotoacustica acquisizione delle immagini anatomiche e vascolare
   1. Inserire la modalità B acquisizione dell'immagine, impostare tutti i parametri di acquisizione di immagini come precedentemente riportato (figura 3) e diffondere i necessari strati di gel ultrasuoni sulla sonda e sulla nuca animali.
   2. Disporre il trasduttore di rimanere quasi orizzontale, in order essere diretto lungo posteriore ad anteriore all'asse anatomiche del corpo. Puntare verso il lato anteriore del muso e inclinarlo leggermente in avanti.
   3. Inizia l'acquisizione delle immagini in modalità B e Modalità Color Doppler (figure 3 e 6). Registrare correttamente il trasduttore di posizione e rimuovere le bolle d'aria dal gelcoat come precedentemente descritto. Se possibile, fissare il trasduttore su una posizione ferma per controllare l'orientamento in modo fine e scegliere il miglior angolo di inclinazione per acquisire immagini delle regioni anatomiche desiderate.
   4. Visualizza i vasi sanguigni del cervello interni in modalità Doppler Potenza, impostando opportunamente i parametri di acquisizione (Figura 7).
   5. Localizzare arterie intensamente pulsate di Pulsed modalità Doppler Wave. Distinguerle dalle vene, che al contrario sono caratterizzati da bassi livelli di flusso sanguigno pulsazione.
   6. Prelevare il sangue flusso di dati velocità e direzioni in Color Doppler Mode, attraverso un adeguato adattamento acqParametri uisition (Figura 6).
   7. Completa emodinamica cerebrale set di dati di caratterizzazione profonda, aggiungendo informazioni sangue chimico ottenuto tramite l'acquisizione fotoacustico (Figura 8). Eseguire questa valutando in particolare la quantità di parametri ematici come la percentuale di saturazione O ₂ e il contenuto totale di emoglobina (HBT), che sono generalmente misurata impostando il laser di eccitazione lunghezza d'onda a 750 e 850 nm (Figura 8c).

4. Fine di acquisizione e di rimozione degli animali

NOTA: correttamente considerare tutto il tempo dedicato al processo di acquisizione dell'immagine (dal punto 1 al punto 3), che viene sottoposto a principali limitazioni relative alla dose di anestetico apposto sull'animale.

1. Salvare tutti i dati acquisiti, ruotare il laser pulsa fuori uscendo dalla modalità di acquisizione fotoacustico e allontanare il trasduttore.
2. Pur mantenendo la animal sotto l'effetto dell'anestesia, inizia a pulire rimuovendo delicatamente il gel protettivo dagli occhi con un batuffolo di cotone bagnato. Utilizzare una spatola e diversi tovaglioli di carta per rimuovere completamente il gel per ultrasuoni dalla testa e il muso, poi pulirli con una spugna umida. Fare attenzione a non danneggiare la pelle rasata delicata.
3. Estrarre il cerotto adesivo utilizzato per fissare gli arti e staccare dai sensori che monitorano i parametri fisiologici. Rapidamente trasferire l'animale dal piano di lavoro acquisizione una gabbia diversa.
4. Host l'animale in una piccola gabbia per il recupero dall'anestesia. Assicurarsi che gli animali non devono condividere la gabbia durante questa fase per evitare aggressioni
5. Posizionare la gabbia di recupero sotto una luce a infrarossi per mantenere il caldo animale. Attendere che ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale. Controllare le condizioni di salute generali degli animali, prima di passare alla camera allevamento degli animali.

Results

Questo metodo permette di immagine sia per strutture di riferimento anatomici e vasi sanguigni specifici relativamente alta risoluzione spaziale, più profondo della tecnica attuale con la pelle degli animali e del cranio intatto. Nelle nostre condizioni sperimentali la profondità del segnale PA è di 4,5 mm e la risoluzione assiale è 75 micron con un FOV 23 x 15,5 cm. Esperimenti con fotoacustico Tomografia modalità ¹⁹ hanno mostrato un valore della risoluzione <1 mm. L'intervallo di valori SNR è da 21,6 dB a 23,8 dB (ottenuti da 5 punti diversi selezionati casualmente sul tessuto cerebrale e sfondo). Accostando il trasduttore sul lato temporale cranio, immagini cerebrali possono essere acquisite come sezioni trasversali o coronali sulla base dell'angolo di posizionamento selezionato del trasduttore con un punto di imaging laterale risultante di vista (figura 4). Epidermide, ossa del cranio e materiale parenchimale sono ben rappresentati in ultrasuoni B-Mode, in quanto sono molto diversi in termini di acimpendence oustic (Figura 10). Anche se la loro configurazione dipende dal punto di vista scelto, alcuni siti di riferimento anatomici sulla parenchima sono riconoscibili, come fessure separano cervello porzione interna dalla corteccia e la forma caratteristica di tratto ottico (Figura 10). Inoltre, un gran numero di navi sono visibili sia in modalità di imaging ad ultrasuoni e fotoacustico. Intersezioni caratteristici della carotide interna Arteria (ICA) con altri principali grandi vasi che corrono lungo la superficie laterale esterna del cervello dell'animale possono essere facilmente riconosciuti. Grandi percorsi vascolari, come la ICA, forniscono un massiccio afflusso di sangue per soddisfare l'esigenza neuronale consistente di energia e ossigeno. L'ICA, nasce dalla carotide comune (CCA), corre sulla parte laterale della testa a parecchi millimetri di profondità, va al di là tutti i suoi siti di biforcazione e, infine, raggiunge la porzione di testa frontale. Questo flusso sanguigno principale diffonde tra intermediate dimensioni vasi, prima di essere incanalata in arteriole sempre più piccoli per nutrire finalmente neuroni. Dal punto di vista temporale, è possibile risalire al modello interno dell'arteria cerebrale, che si biforca in navi dirette al lato anteriore e laterale del cervello. Immagini coronali e trasversali possono essere acquisiti con diversa inclinazione del trasduttore rispetto alla direzione dell'asse virtuale unisce l'occhio e il padiglione auricolare dell'animale (Figura 4). Inclinando il trasduttore secondo le proiezioni descritte nella Figura 4, è possibile ottenere immagini di risolte cerebrale media (MCA) che deriva da ICA e ulteriori divide in due o più rami, che finalmente circondano lobi corticali (figure 11 e 12). I migliori sono stati ottenuti per visualizzazioni MCA con l'inclinazione sonda come mostrato nella Figura 4c e ICA come mostrato in Figura 4b.

L'elaborazione acustica basata Doppler-rivela piccoli rami, mentre informazioni direzionali della corrente sanguigna è disponibile grazie all'acquisizione Color Doppler (Figura 13). Caratteristica arteria MCA è confermato da onda pulsata tecnica ultrasonica (figure 14 e 15). Segnale fotoacustico di emoglobina contenuta in circolanti globuli rossi può essere rilevato e analizzato per raccogliere dati sul suo stato ossidativo molecolare e per calcolare la saturazione di ossigeno nel sangue (figure 16 e 17). Contenuto di ossigeno ematico può essere correlato ai dati sonori per confermare la discriminazione del sangue arterioso dal sangue venoso.

Puntando il trasduttore verso il forame occipitale, la visione viene proiettata sul piano assiale testa (Figura 9) e questo piano dell'immagine può essere regolata su angoli di inclinazione variabile. In questo caso, il punto di imaging vista posteriore del cervello potrebbe essere connotato da una profondità di penetrazione elevata, a causa della grande voce occipitale. Il Circolo di Willis, una caratteristica configurazione dell'imbarcazione nel cervello profondo, può essere localizzato ed esaminato applicando tutte le tecniche di cui sopra. Dell'arteria basilare (BA), in esecuzione sul lato ventrale del cervelletto, alla fine porta a dell'encefalo e si biforca simmetricamente in due rami. Questi due rami sul cervello ventrale sparsi e poi si uniscono di nuovo insieme, quindi la creazione di una struttura ad anello (Circolo di Willis). Questo circolo profondo basale è il seminterrato vascolare da cui tutti i vasi sanguigni di medie dimensioni presentano, come le arterie posteriore, medio e anteriore cerebrale (PCA, MCA e ACA, rispettivamente), che sono i principali effettori di un massiccio afflusso di sangue al cervello . In Color Doppler modalità, l'identificazione di rami medie dimensioni è fattibile e permette la chiara visualizzazione di segmenti vascolari curvi (come la PCA) entrare nel circolo di Willis (Figura 18).

nt "> Il tessuto parenchimale cerebrale stato anche registrato con PA in modalità occipitale proiezione (Figura 19) per mostrare la caratterizzazione vascolare nel grafico spettrale (Figura 20). Con questo spettro è possibile distinguere il segnale derivato da vasi arteriosi e venosi.

Figura 1: Posizione di forami cranio e rispettivo punto di vista per l'acquisizione delle immagini La testa di ratto di profilo (a) ei siti in cui il dispositivo di imaging trasduttore può essere posizionato per essere giustapposti su forame temporali (freccia viola) e il forame occipitale. (freccia gialla) sul profilo (b).

Figura 2: lo smaltimento degli animali per un'immagine temporale acquisition. (A) La disposizione dell'animale sul piano di lavoro per l'acquisizione delle immagini: dopo testina di rasatura, l'animale viene posto in posizione prona con il corpo leggermente inclinata su un lato in modo da esporre il lato temporale della testa. Il piano di lavoro può essere eventualmente dotato di un dispositivo di riscaldamento per mantenere il corpo caldo dell'animale durante l'acquisizione. Alcuni rulli di cotone possono essere utilizzati per ottenere la posizione, mentre cerotti adesivi fissare le zampe dei sensori per il monitoraggio dei segni vitali. (B) uno strato consistente di gel ultrasuoni copre l'area della testa su cui verrà posizionato il trasduttore durante l'imaging.

Figura 3: i parametri di acquisizione per l'imaging B-Mode. (A) Un screenshot illustrativo che mostra il pannello di segnalazione importanti parametri di acquisizione utilizzati per l'imaging cerebrale in B-MODE. (B) È importante sottolineare che la frequenza di trasmissione è stato impostato su valori bassi (16 MHz) per migliorare la penetrazione nei tessuti degli Stati Uniti.

Figura 4: acquisizione dell'immagine trasversale dal forame temporale (a) Il riferimento virtuale asse che unisce il padiglione auricolare per l'occhio e il movimento di inclinazione (freccia rossa) per variare l'inclinazione trasduttore e il piano di acquisizione dell'immagine; (b) antiorario movimento rispetto al. asse di riferimento ear-to-eye e inclinazione variabile del trasduttore di posizione; c) il movimento in senso orario rispetto al riferimento all'asse ear-to-eye e inclinazione variabile del trasduttore di posizione.

Figura 5: la profondità di messa a fuoco ottimale per USe l'acquisizione di immagini PA. Mentre cerca per l'area di interesse, la profondità di messa a fuoco delle immagini (rappresentato da un triangolo giallo) deve essere fissato a circa 10 mm di profondità dalla sorgente / laser US, al fine di ottenere una prestazione ottimale delle immagini.

Figura 6: i parametri di acquisizione di immagini a colori Modalità Doppler. (A) Prima di iniziare l'acquisizione di immagini a colori in modalità Doppler, l'opzione di gate respirazione può essere attivata, per evitare l'artefatto generato da movimenti respiratori fisiologici. (B) Un schermo esemplificativa mostra importanti parametri di acquisizione impiegate per l'imaging del cervello in Color Doppler Mode.

Figura 7: Acquisizione parametri per l'imaging modalità Doppler alimentazione. Un screenshot illustrativo che mostra importanti parametri di acquisizione utilizzati per l'imaging del cervello in modalità Doppler Potenza.

Figura 8: parametri di acquisizione per l'imaging modalità fotoacustico. (A) Il pannello di segnalazione importanti parametri di acquisizione impiegate per l'imaging del cervello in modalità fotoacustico. (B) Acquisizione di uno spettro fotoacustico, basato su un laser di eccitazione che va da 680 nm a 970 nm, con un intervallo di lunghezza d'onda di 5 nm (riferimento come step dimensione). (parametri c) acquisizione impiegati per singola onda Modalità fotoacustico a 750 nm e 850 nm, per la discriminazione dei segnali de-ossigenato e ossigenate emoglobina rispettivamente.

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Figura 9:. Acquisizione dell'immagine trasversale dal foro occipitale (a) posizionamento trasduttore sul collo dell'animale (freccia gialla) e il piano di imaging risultante trasversale praticamente sezioni testa sulla direzione caudo-rostrale; (b) vista posteriore del posizionamento trasduttore e piano di acquisizione dell'immagine.

Figura 10:. Acquisizione B-Mode dal forame temporali per l'individuazione di riferimenti anatomici Epidermide (a), del cranio (b) e parenchima (c) può essere facilmente distinguibili, ma anche altri riferimenti anatomici possono essere rilevate, come la fessura ( d) che circonda la porzione cerebrale profonda ventrale e la caratteristica forma del tratto ottico (e).

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Figura 11: Power Doppler acquisizione modalità attraverso forame temporali per l'individuazione di riferimenti vascolari MCA alzando dalla ICA sul lato cervello temporale.. Per ottenere questa visione, immagine trasversale è stata acquisita puntando trasduttore sulle forame temporali e ruotandola in senso antiorario.

Figura 12: Power Doppler acquisizione modalità attraverso forame temporali per l'individuazione di riferimenti vascolari MCA alzando dalla ICA sul lato cervello temporale.. Per ottenere questa visione, immagine trasversale è stata acquisita puntando trasduttore sulle forame temporali e ruotandolo in senso orario.

Figura 13: Color Doppler acquisizione modalità attraverso forame temporali per l'individuazione di riferimenti vascolari MCA alzando dalla ICA sul lato cervello temporale.. Informazioni direzionale del flusso sanguigno è espressa mediante una barra di scala colori, distinguendo tra movimenti flusso diretto verso il dispositivo trasduttore e lontano da esso.

Figura 14: acquisizione Wave Mode pulsata attraverso forame temporali per l'individuazione di riferimenti vascolari conferma delle proprietà arterie di sangue che circola all'interno dei vasi che sono stati identificati come ipoteticamente arterie:. Wave Mode pulsata fornisce informazioni sulla variazione del flusso velocità, che può essere correlato per effetto pulsazione cardiaca (più intense nelle arterie che nelle vene).

Figura 15: Pulsed onda acquisizione modalità attraverso forame temporali per l'individuazione di riferimenti vascolari identificazione da Wave Mode pulsata dei vasi sanguigni, come le vene, in cui l'effetto pulsazione cardiaca sul flusso velocità è trascurabile..

Figura 16: Modalità di acquisizione fotoacustico attraverso forame temporali per l'individuazione di riferimenti vascolari. Vasi interni parenchimali nel lato del cervello temporale visualizzato da B-Mode (sinistra) e Single-wave modalità fotoacustico (a destra). I colori della barra di scala riflettono diversi valori di intensità di segnale fotoacustico, indotte da una eccitazione laser eseguita a una lunghezza d'onda selezionata. In order di individuare le vene e le arterie, le lunghezze d'onda di eccitazione può essere impostato a 750 e 850 nm, che rappresentano i valori per ottenere rispettivamente i picchi di emissione fotoacustico per l'emoglobina deossigenata e ossigenata.

Figura 17: Modalità di acquisizione fotoacustico attraverso forame temporali di discriminazione emoglobina ossigenata e de-ossigenato. Navi interne nel lato del cervello temporale visualizzato da B-Mode (a sinistra) e la modalità fotoacustico Oxy-Hemo (a destra). I colori della barra di scala riflettono diversi valori percentuali di saturazione di ossigeno dell'emoglobina nel sangue.

Figura 18: acquisizione Modo colore Doppler attraverso forame occipitale per l'individuazione di riferimenti vascolari.Segmenti vascolari curve creando la struttura del basamento del Circolo di Willis, che si trova nella parte ventrale del cervello.

Figura 19: fotoacustico e B-Mode acquisizione attraverso forame occipitale per l'individuazione di riferimenti vascolari. Nell'immagine in B-mode si possono evidenziare le Strutture Anatomiche individuabili con la PROIEZIONE occipitale e Nella Corrispondente Acquisizione con Modalità fotoacustica con rilevamento spettrale di tra 670 nm a 980 nm (con step di 5 nm).

Figura 20: fotoacustico e B-Mode acquisizione attraverso forame occipitale per l'individuazione di riferimenti vascolari. In this immaginare Vienne rappresentato Lo spettro una corrispondentente alle tre ROI tracciate un Livello del parenchima cerebellare; in Particolare Sono tracciate un Livello di tre Strutture vascolari, la cui tipologia si Differenzia un Livello dell'andamento spettrale (ROI fuxia e celeste corrispondono a Strutture vascolari venose; ROI gialla una corrispondente at a Struttura vascolare arteriosa).

Discussion

Il protocollo presentato è stato ottimizzato per fornire altamente efficace prestazioni di imaging cerebrale nei piccoli animali. Le immagini possono essere acquisite in diverse modalità, seguendo appunto le indicazioni circa i parametri di acquisizione e il posizionamento del trasduttore sul cranio forami. In particolare, il posizionamento sul lato temporale è la più critica, poiché gli Stati Uniti e il laser dobbiamo essere centrata nel modo più preciso possibile penetrare correttamente il forame, che è più piccolo di quello occipitale. Tuttavia, grazie a questa impostazione sperimentale, caratteristiche emodinamiche legate ai concorsi fisiologiche o patologiche sono accessibili e possono essere valutati anche in regioni cerebrali profonde, che sono solitamente difficili da caratterizzare.

Poiché acquisizione dell'immagine successo dipende dalla precisione del posizionamento trasduttore, questa dipendenza deve essere attentamente presi in considerazione perché può influire sulle prestazioni di imaging. Per esempio,alcune strutture anatomiche di interesse potrebbero non essere del tutto compresi nel piano di imaging acquisizione e la loro identificazione da immagini che offrono solo una visione parziale potrebbe risultare non ottimale. Inoltre, l'acquisizione di immagini e US PA eseguito in una modalità tridimensionale (Modalità 3D) non sarebbe compatibile con l'impostazione sperimentale descritto in precedenza, in quanto richiede il trasduttore a muoversi lungo un percorso automatizzato predefinito. Infine, a causa della variabilità naturale anatomica, la dimensione delle aperture cranio può variare significativamente tra gli animali, avendo così ripercussioni imprevedibili sul processo di acquisizione. Questo fatto rende la qualità dell'immagine dipende dalle caratteristiche di ogni individuo. Di conseguenza, l'impossibilità di applicare questa strategia ad alcuni animali deve essere considerato nella progettazione del protocollo sperimentale.

In particolare, un notevole interesse è destinataria emodinamica, grazie al suo ruolo fondamentale nel determinare labiodistribuzione di farmaci o altre molecole esogene dopo somministrazione sistemica ^28-29. Le implicazioni applicative nel campo dell'imaging molecolare sono molti, che vanno dalla validazione di agenti di contrasto di imaging blood pool di studi drug delivery immagine monitorata richiedono ultrasuoni indotta BBB apertura ^30. Tutti questi scopi di ricerca sarà certamente beneficiare della invasività del protocollo, visto che, senza ulteriori interventi chirurgici, il rischio di morte o di effetti collaterali indesiderati è sostanzialmente ridotto e monitoraggio a lungo termine sugli stessi modelli animali è fattibile.

In sintesi, il protocollo presentato consentirà al professionista di immagine in modo efficiente e interpretare correttamente la topografia anatomica e il pattern vascolare normali o patologici tessuti cerebrali in modelli animali di ricerca uso. Mentre i metodi attuali sono principalmente limitati a tomografiche di imaging corticale ^25-27, questa impostazione dà l'opportunità to illustrare diversi processi che influenzano profondamente la fisiologia del cervello, fondendo i vantaggi offerti da entrambi immagini Uniti e PA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stazione di imaging ad ultrasuoni e fotoacustica ad alta frequenza (sistema VEVO LAZR 2100)	FUJIFILM VisualSonics Inc.
Sistema di anestesia doppio compatto Vevo (versione da tavolo)	FUJIFILM VisualSonics Inc.		http://www.visualsonics.com/anesthesiasystem#sthash.opODt Sht.dpuf
Gel per la trasmissione degli ultrasuoni (Aquasonic 100)	Parker Laboratories Inc.	01-08	http://www.parkerlabs.com/aquasonic-100.asp
ratti Sprague-Dawley Charles	River Laboratories		Tre ratti Sprague-Dawley sani di 6 settimane sono stati acquistati dai Charles River Laboratories e tenuti in stabulazione standard (cicli luce-buio di 12 ore) con un cibo standard per roditori e acqua disponibile ad libitum. Servizio fornito da: http://www.criver.com/