Microscopie à force atomique de Red-Light photorécepteurs Utilisation de l'association PeakForce quantitative nanomécanique propriété
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
La microscopie à force atomique (AFM) utilise une pointe pyramidale fixée à un porte à faux à sonder la réaction d'une surface de force. Les déviations de la pointe peut être mesurée à ~ 10 pN par un laser et d'un détecteur à secteurs, qui peut être converti à l'image de la topographie. Modulation d'amplitude ou "tapping mode" AFM implique la sonde en contact intermittent avec la surface en oscillant à sa fréquence de résonance pour produire une image. Utilisé en association avec une cellule de fluide, en mode taraudage AFM permet l'imagerie des macromolécules biologiques telles que les protéines dans des conditions physiologiquement pertinentes. Mode Tapping AFM nécessite un réglage manuel de la sonde et de fréquents ajustements d'une multitude de paramètres d'analyse qui peut être difficile pour les utilisateurs inexpérimentés. Pour obtenir des images de haute qualité, ces ajustements sont les plus coûteux en temps.
PeakForce quantitative nanomécanique Property Mapping (PF-QNM) produit une image en mesurant une respon forcecourbe soi pour chaque point de contact avec l'échantillon. Avec le logiciel de ScanAsyst, PF-QNM peut être automatisé. Ce logiciel permet de régler le point de consigne, la fréquence d'entraînement, vitesse de balayage, les gains, et d'autres paramètres de numérisation importants automatiquement pour un échantillon donné. Non seulement ce processus à protéger les deux sondes et les échantillons fragiles, il réduit considérablement le temps nécessaire pour obtenir des images à haute résolution. PF-QNM est compatible pour l'imagerie AFM dans le liquide; par conséquent, il a une large application pour l'imagerie de matériaux biologiquement pertinents.
La méthode présentée dans ce document décrit l'application de PF-QNM d'obtenir des images d'un photorécepteur de lumière rouge bactérienne, RpBphP3 (P3), de la photosynthèse R. palustris dans son état adapté à la lumière. En utilisant cette méthode, les dimères de protéines individuelles de P3 et des agrégats de dimères ont été observées sur une surface de mica en présence d'un tampon d'image. Avec les ajustements appropriés à la surface et / ou de la concentration de la solution, cette méthodepeuvent généralement être appliquées à d'autres macromolécules d'intérêt biologique et de matériaux souples.
Introduction
Microscopie à force atomique (AFM) est devenu un outil très important pour l'étude des propriétés structurales et mécaniques des surfaces, couches minces, et des molécules simples depuis son invention en 1986 (Figure 1). 1-3 Utilisation d'une cellule de liquide, la méthode a devenir particulièrement utile dans les études des macromolécules biologiques et même de cellules vivantes dans un environnement physiologiquement pertinents. 4-10 Tapping mode AFM a traditionnellement été utilisé pour l'imagerie des tissus mous ou des molécules faiblement liées à la surface, car le contact en mode AFM est généralement inadaptés en raison de pour les dommages causés par les forces latérales exercées sur l'échantillon par la console. 11 Tapping mode AFM permet de réduire considérablement ces forces en ayant la pointe intermittence toucher la surface plutôt que d'être en contact permanent. Dans ce mode, le cantilever est amené à osciller à ou près de sa fréquence de résonance normale à la surface. De même pour communiquer avec mode AFM, la topographie est analyzed en traçant le mouvement de la piézo-z comme une fonction de xy (distance).
La dynamique en porte à faux peuvent être très instable à ou près de résonance; par conséquent, ils sont très difficiles à automatiser l'extérieur d'une situation dite de «stabilisation». Plus précisément, ces dynamiques dépendent à la fois les propriétés de l'échantillon et de l'environnement de la numérisation. Pour une molécule doux adsorbé à un (re) surface dure, une boucle de rétroaction bien réglé pour la molécule peut engendrer un retour oscillation de la surface. Fonctionnement en fluide complique encore la mise au point de la poutre. Changements dans les niveaux de température ou fluides exigent un réajustement constant de point de consigne, les gains, et d'autres paramètres d'imagerie. Ces ajustements ont tendance à prendre beaucoup de temps et très difficile pour les utilisateurs.
Property Mapping pic de travail quantitative nanomécanique (PF-QNM), comme le mode de percussion AFM, d'éviter les interactions latérales en contactant par intermittence l'échantillon (Figure 2). 12-15 </ Sup> Toutefois, PF-QNM fonctionne en mode et fréquences beaucoup plus basses que-tapping mode AFM non-résonance. Ceci élimine les problèmes de réglage de mode taraudage AFM, en particulier ceux exacerbé par la présence de fluide. Avec PF-QNM, les images sont recueillies en prenant une courbe de réponse de la force à chaque point de contact. Avec l'ajout de logiciels de ScanAsyst, 15 réglage des paramètres de numérisation peut être automatisée et une image à haute résolution obtenue dans une affaire de minutes, même par des utilisateurs inexpérimentés. Une fois que l'utilisateur se familiarise avec l'AFM, tout ou partie des paramètres automatiques peuvent être désactivées à tout moment qui permet à l'expérimentateur d'affiner la qualité de l'image manuellement. Depuis sa création, le PF-QNM a été appliquée à la carte bactériorhodopsine, une protéine de la membrane, et d'autres protéines natives au niveau submoléculaire. 16-18 Pour bactériorhodopsine, il existe une corrélation directe entre la flexibilité des protéines et X-ray structures cristallographiques. PF 12 -qnM a été utilisée pour étudier des cellules vivantes avec une résolution élevée. 19,20 liens importants outre, les données PF-QNM a élucidés entre la structure et la mécanique dans la membrane des érythrocytes qui sont critiques pour l'intégrité et la fonction des cellules. 21
Nous avons utilisé la microscopie à sonde à balayage (SPM) méthodes, 22 y compris AFM, 23 pour étudier la structure des photorécepteurs aux feux rouges appelé bactériophytochromes (BphPs). 24,25 Ils se composent d'un module de détection de lumière lié de façon covalente à un module de signalisation effecteur tel comme l'histidine kinase (HK) 26. Le module de détection de lumière comprend généralement un chromophore bilin qui subit une transformation structurelle lors de l'absorption d'un photon, avec une série de modifications structurelles qui atteignent le module de signalisation de l'effecteur et conduisant à une transformation globale de la protéine entière . 24,27-29 base de cette transformation, il ya deux lumière distincte absorbant stats de BphPs, un état absorbant la lumière rouge et rouge lointain, désignés comme Pr et Pfr. Pr est thermiquement stable, état adapté à l'obscurité pour la plupart des BphPs. 28 La base moléculaire de Pr / Pfr photoconversion n'est pas entièrement comprise en raison de la connaissance structurelle limitée de ces protéines. A l'exception d'une structure de D. radiodurans, tous les 30 rayons X publiée structures cristallographiques de ces protéines sont dans l'état adapté à l'obscurité et manquent de domaine effecteur. Les BphPs intacts sont trop gros pour être étudié de manière efficace par résonance magnétique nucléaire (RMN) et sont notoirement difficiles à cristalliser dans leur forme intacte (en particulier dans l'Etat de lumière adapté) pour la cristallographie aux rayons X. BphPs ont récemment été conçu en tant que marqueurs de protéines fluorescentes infrarouge (IFP). 31 Caractérisation structurale de ces protéines peut favoriser l'aide à la conception IFP efficace. 32-36
Est l'objet de cet article de présenter une procédure pourde formation d'image à l'aide de l'AFM BphPs liquide-cellule par l'intermédiaire de PF-QNM. La méthode est démontrée par des études de l'état de lumière adaptée de la bactériophytochrome RpBphP3 (P3) de la bactérie photosynthétique R. palustris. La procédure de l'AFM approche présentée ici est simple et commode pour l'imagerie de protéines ainsi que d'autres macromolécules biologiques. Avec cette méthode, les détails de structure des molécules individuelles peuvent être collectées dans un court laps de temps, similaire à une session de cours de science de laboratoire de niveau supérieur. Grâce à la mesure de sections et de compléter d'autres analyses dimensionnelles, les données expérimentales peuvent être comparés à des modèles informatiques utiles. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
L'AFM est un procédé de microscopie à sonde de balayage tout à fait capable d'imager des protéines et d'autres macromolécules biologiques dans des conditions physiologiquement pertinentes. En comparaison à la cristallographie aux rayons X et RMN, une des limites de l'AFM est son incapacité à obtenir la même résolution, en particulier la résolution latérale. Lors de l'utilisation de l'AFM analyser une molécule sur une surface, l'impact de la surface et la sonde sur l'image de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le programme NSF-IRM (CHE: 1229103) est reconnu pour financer l'achat de nouveaux appareils électroniques de contrôle, des logiciels, des cellules liquides, et d'autres équipements nécessaires à l'assemblage d'un double AFM / STM. Nous reconnaissons les équipements communs à l'Université de Chicago programme NSF-MRSEC (DMR-0820054) pour l'assistance avec l'AFM instrumentation, de la formation et de l'imagerie, et pour le temps de l'instrument mis à disposition par le Réseau Installations de recherche Matériaux (DMR-0820054). Nous remercions tout particulièrement le Dr Qiti Guo, le Dr Justin Jureller, et le professeur Ka Yee Lee pour accueillir nos étudiants avant que le financement de la proposition NSF-IRM qui a l'instrumentation nécessaire à notre campus. Nous reconnaissons le financement d'une subvention STEM titre III (ID: P031C110157) confiée à l'Université Northeastern Illinois qui a fourni des bourses de recherche d'été pour les étudiants et les professeurs ainsi que le soutien pour les consommables. Enfin, nous reconnaissons Bruker-Nano, Inc. pour le soutien instrumental continue et la permission de reproduce un graphique montrant le mécanisme de PeakForce QNM et d'utiliser le mot ScanAsyst pour décrire le logiciel automatisé.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
Riferimenti
- Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).
- Sonnenfeld, R., Hansma, P. K. Atomic-Resolution Microscopy in Water Science. 232, 211-213 (1986).
- Nikiforov, M. P., Darling, S. B. Concurrent Quantitative Conductivity and Mechanical Properties Measurements of Organic Photovoltaic Materials using AFM. J. Vis. Exp. 71, (2013).
- Bahatyrova, S. The Native Architechure of a Photosynthetic Membrane. Nature. 430, 1058-1061 (2004).
- Sturgis, J. N., Tucker, J. D., Olsen, J. D., Hunter, C. N., Niederman, R. A. Atomic Force Microscopy Studies of Native Photosynthetic Membranes. Biochem. 48, 3679-3698 (2009).
- Pelling, A. E., Li, Y., Shi, W., Gimzewski, J. K. Nanoscale visualization and characterization of Myxococcus xanthus cells with atomic force microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102, 6484-6489 (2005).
- Viani, M. B. Probing Protein-Protein Interactions in Real-Time. Nature: Structural Biology. 7, 644-648 (2000).
- Hook, F., Kasemo, B., Grunze, M., Zauscher, S. Quantitative Biological Surface Science, Challenges and Recent Advances. ACS Nano. 2, 2428-2436 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).
- Murphy, P. J. M., Shannon, M., Goertz, J. Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy. J. Vis. Exp. (53), (2011).
- Poggi, M. A. Scanning Probe Microscopy. Anal. Chem. 76, 3429-3444 (2004).
- Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical Mapping of Single Membrane Proteins at Submolecular Resolution. Nano Letters. 11, 3983-3986 (2012).
- Foster, B. The State of Microscopy for 2012. Amer. Lab. 43, 4-6 (2011).
- Guzman, H. V., Perrino, A. P., Garcia, R. Peak Forces in High-Resolution Imaging of Soft Matter in Liquid. ACS Nano. 7, 3198-3204 (2013).
- Kaemmer, S. B. Introduction to Bruker’s ScanAsyst and PeakForce Tapping AFM Technology. , (2011).
- Dufrêne, Y. F., Martinez-Martin, D., Medalsy, I., Alsteens, D., Muller, D. J. Multiparametric imaging of biological systems by force-distance curve-based AFM. Nature Methods. 10, 847-854 (2013).
- Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve–based AFM. Nature Protocols. 9, 1113-1130 (2014).
- Pfreundschuh, M., Alsteens, D., Hilbert, M., Steinmetz, M. O., Muller, D. J. Localizing Chemical Groups while Imaging Single Native Proteins by High-Resolution Atomic Force Microscopy. Nano Letters. 14, 2957-2964 (2014).
- Berquanda, A. Atomic Force Microscopy Imaging of Living Cells. Microscopy Today. 18, 8-14 (2010).
- Heua, C., Berquand, A., Elie-Cailleb, C., Nicoda, L. Glyphosate-induced Stiffening of HaCaT Keratinocytes, a Peak Force Tapping Study on Living Cells. J. Struc. Biol. 178, 1-7 (2012).
- Picas, L., Rico, F., Deforet, M., Scheuring, S. Structural and Mechanical Heterogeneity of the Erythrocyte Membrane Reveals Hallmarks of Membrane Stability. ACS Nano. 7, 1054-1063 (2013).
- Tobias, F. G. Scanning Probe Microscopy of Bacterial Red-Light. Proc. 1465, doi:10.1557/opl.2012.1006. , (2012).
- Sorenson, B. A. Domain Structure of a Unique Bacterial Red Light Photoreceptor as Revealed by Atomic Force Microscopy. Mater. Res. Soc. Symp. Proc. 1652, (2013).
- Rockwell, N. C., Lagarias, J. C. The structure of phytochrome: a picture is worth a thousand spectra. Plant Cell. 18, 4-14 (2006).
- Rockwell, N. C., Shang, L., Martin, S. S., Lagarias, J. C. Distinct classes of red/far-red photochemistry within the phytochrome superfamily. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 6123-6127 (2009).
- Noack, S., Michael, N., Rosen, R., Lamparter, T. Protein conformational changes of Agrobacterium phytochrome Agp1 during chromophore assembly and photoconversion. Biochem. 46, 4164-4176 (2007).
- Noack, S., Lamparter, T. Light modulation of histidine-kinase activity in bacterial phytochromes monitored by size exclusion chromatography, crosslinking, and limited proteolysis. Methods of Enzymology. 423, 203-221 (2007).
- Rockwell, N. C., Su, Y. S., Lagarias, J. C. Phytochrome structure and signaling mechanisms. Annual Review Plant Biology. 57, 837-856 (2006).
- Bhoo, S. H., Davis, S. J., Walker, J., Karniol, B., Vierstra, R. D. Bacteriophytochromes Are Photochromic Histidine Kinases Using a Biliverdin Chromophore. Nature. 414, 776-779 (2001).
- Takala, H. Signal amplification and transduction in phytochrome photosensors. Nature. 509, 245-248 (2014).
- Filonov, G. S. Stable Near-Infared Fluorescent Protein for in vivo Imaging. Nature Biotech. 29, 757-761 (2011).
- Samma, A. A., Johnson, C. K., Song, S., Alvarez, S., Zimmer, M. On the Origin of Fluorescence in Bacteriophytochrome Infrared Fluorescent Proteins. J. Phys. Chem. B. 114, 15362-15369 (2011).
- Lehtivuori, H. Fluorescence Properties of the Chromophore-Binding Domain of Bacteriophytochrome from Deinococcus radiodurans. J. Phys. Chem. B. 117, 11049-11057 (2013).
- Toh, K. C. Primary Reactions of Bacteriophytochrome Observed with Ultrafast Mid-Infrared Spectroscopy. J. Phys. Chem. A. 115, 3778-3786 (2011).
- Auldridge, M. E., Satyshur, K. A., Anstrom, D. M., Forest, K. T. Structure-guided engineering enhances a phytochrome-based infrared fluorescent protein. J. Biol. Chem. 287, 7000-7009 (2012).
- Toh, K. C., Stojkovic, E. A., van Stokkum, I. H., Moffat, K., Kennis, J. T. Proton-transfer and hydrogen-bond interactions determine fluorescence quantum yield and photochemical efficiency of bacteriophytochrome. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 107, 9170-9175 (2010).
- . The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1. , .
- Yang, X., Stojkovic, E. A., Kuk, J., Crystal Moffat, K. structure of the chromophore binding domain of an unusual bacteriophytochrome, RpBphP3, reveals residues that modulate photoconversion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 12571-12576 (2007).
- Yang, X., Kuk, J., Moffat, K. Crystal structure of Pseudomonas aeruginosa bacteriophytochrome: photoconversion and signal transduction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 14715-14720 (2008).
- Woitowich, N. K., Garrido, C., Ozarowski, W., Stojkovic, E. A. Preliminary X-ray Crystallographic and Structural Analyses of a Bacteriophytochrome from Stigmatella aurantiaca. The FASEB Journal. 25, 928 (2011).
- Wagner, J. R., Zhang, J., Brunzelle, J. S., Vierstra, R. D., Forest, K. T. High resolution structure of Deinococcus bacteriophytochrome yields new insights into phytochrome architecture and evolution. J. Biol. Chem. 282, 12298-12309 (2007).
- Wagner, J. R. Mutational analysis of Deinococcus radiodurans bacteriophytochrome reveals key amino acids necessary for the photochromicity and proton exchange cycle of phytochromes. J. Biol. Chem. 283, 12212-12226 (2008).
