PeakForce 양적 나노 기계 대지 매핑을 사용하여 붉은 빛이 광수의 원자 힘 현미경
Summary
A method for investigating the structure of a protein photoreceptor using atomic force microscopy (AFM) is described in this paper. PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) reveals intact protein dimers on a mica surface.
Abstract
원자 힘 현미경 (AFM)의 표면의 힘에 응답을 프로빙 캔틸레버에 부착 피라미드 팁을 이용한다. 팁의 편향은 지형 화상으로 변환 될 수 레이저 및 섹터 탐지기에 의해 10 ~ PN 측정 할 수있다. 진폭 변조 또는 "탭핑 모드"는 AFM 이미지를 생성하기 위하여 그것의 공진 주파수로 진동하면서 표면 간헐적 접촉하는 프로브를 포함한다. 유체 세포와 함께 사용, 태핑 모드 AFM은 생리 학적으로 관련 조건에서 단백질과 같은 생물학적 거대 분자의 이미징을 할 수 있습니다. 태핑 모드 AFM 프로브와 경험이없는 사용자를 위해 도전 할 수있는 스캔 매개 변수의 다수의 빈번한 조정의 수동 튜닝이 필요합니다. 고품질 화상을 얻기 위해서는, 이러한 조정은 대부분의 시간을 소비한다.
PeakForce 정량적 나노 기계 공간 매핑 (PF-QNM)가 힘을 측정함으로써 respon 이미지를 만들어샘플과 접촉의 모든 지점에 대한 자체 곡선. ScanAsyst 소프트웨어로, PF-QNM은 자동화 할 수 있습니다. 이 소프트웨어는 자동으로 주어진 샘플에 대한 설정 점, 구동 주파수, 스캔 속도, 이익, 및 기타 중요한 검색 매개 변수를 조정합니다. 뿐만 아니라이 프로세스가 깨지기 탐침과 시료를 보호 않으며, 그것은 훨씬 높은 해상도의 이미지를 얻기 위해 필요한 시간을 감소시킨다. PF-QNM 유체의 AFM 이미징 호환; 따라서, 생물학적으로 중요한 물질을 이미징하는 광범위한 애플리케이션을 갖는다.
본 논문에서 제시하는 방법은 광합성 R.에서 세균 붉은 빛이 광 수용체, RpBphP3 (P3)의 이미지를 얻기 위해 PF-QNM의 응용 프로그램을 설명합니다 그 빛 적응 상태에서 palustris. 이 방법을 사용하여, 각각의 단백질의 이량 P3와 다이머의 응집체는 촬상 버퍼의 존재 운모 표면에 관찰되었다. 적절한 표면을 조정 및 / 또는 용액 농도,이 방법일반적으로 생물학적 관련 거대 분자와 부드러운 소재에 적용될 수있다.
Introduction
원자력 현미경 (AFM)은 1986 년 발명 (도 1) 이후 표면 박막 및 단일 분자의 구조 및 기계적 특성을 조사하기위한 매우 중요한 도구가되고있다. 1-3 액정 셀을 사용하여, 상기 방법은 보유 생리 학적으로 관련 환경에서 생체 고분자의 연구에도 살아있는 세포에 특히 유용해진다. AFM 전통적 접촉 모드 AFM 때문에, 부드러운 물질 또는 표면에 느슨하게 구속 분자 이미징에 사용되어 4-10 탭핑 모드 인해 일반적 부적합 횡력에 의한 피해에 캔틸레버하여 샘플에 가해진. 11 태핑 모드 AFM은 실질적으로 끝이 간헐적으로 표면을 만지지 가진보다는 일정한 접촉하는 이러한 힘을 감소시킨다. 이 모드에서는, 캔틸레버 또는 표면에 수직의 공진 주파수 근처에서 발진된다. 마찬가지로 AFM 모드를 연락하는 지형 항문이다XY (거리)의 함수로서 Z-피에조의 이동을 플롯하여 yzed.
캔틸레버 역학 또는 공진 근처에 매우 불안정 할 수 있습니다; 따라서, 그들은 "정상 상태"상황 밖에서 자동화 매우 도전적이다. 특히 이러한 역학 샘플 특성과 스캔 환경 모두에 따라 달라집니다. 하드 (어) 표면에 흡착 부드러운 분자를 들어, 분자 잘 조정 피드백 루프는 표면에 대한 피드백 진동의 원인이됩니다. 상기 작동 유체는 캔틸레버의 튜닝을 복잡. 온도 나 유체 수준의 변화는 세트 포인트, 이익, 및 기타 영상 매개 변수의 일정 재조정이 필요합니다. 이러한 조정은 매우 시간 소모적이고 누구나 도전을 경향이있다.
피크 포스 양적 나노 기계 속성 매핑 (PF-QNM)는, 모드 AFM을 눌러처럼 간헐적으로 샘플 (그림 2)에 연락하여 측면의 상호 작용을 방지 할 수 있습니다. 12-15 </ SUP> 그러나, PF-QNM 비 공진 모드 및 태핑 모드 AFM보다 훨씬 낮은 주파수에서 작동합니다. 이것은 탭핑 모드 AFM, 유체의 존재에 의해 악화 특히 튜닝의 과제를 제거한다. PF-QNM을 선택하면 이미지가 접촉의 모든 지점에서 힘 응답 곡선을 복용에 의해 수집됩니다. ScanAsyst 소프트웨어의 추가로, 주사 파라미터 조정 (15)는 자동화 될 수 있고, 높은 해상도 이미지에도 경험이없는 사용자에 의해 분내에 수득. 사용자는 AFM에 익숙하게되면 자동화 된 파라미터의 일부 또는 전부는 수동으로 화질 미세 조정을 허용 실험가 언제든지 비활성화 될 수있다. 그 이래, PF-QNM이. submolecular 레벨 박테리오로돕신, 세포막 단백질 및 다른 천연 단백질을 매핑 적용된 박테리오로돕신 들어 16-18, 단백질 유연성 및 X-선 결정 학적 구조 사이에 직접적인 상관 관계가있다. 12 PF -qnM은 높은 해상도로 살아있는 세포 조사하기 위해 사용되었다. 세포의 무결성과 기능에 대 한 중요 한 적혈구 막 내 구조와 역학 사이 19, 20 또한, PF-QNM 데이터를 밝혀왔다 중요한 연결합니다. (21)
우리는 22 bacteriophytochromes (BphPs)라고 붉은 빛 감광체의 구조를 연구하기 위해 AFM (23)를 포함하여, 주 사형 프로브 현미경 (SPM)의 방법을 채용했다. 24,25 그들은 공유 시그널링 이펙터 모듈 등의보기에 연결된 광 검출 모듈로 구성 히스티딘 키나아제 (HK)로서. 26 광 감지 모듈은 일반적으로 구조 변화 시그널링 이펙터 모듈에 도달하고, 전체 단백질의 전체에 변형 선도의 시리즈, 광자의 흡수에 구조적 변형을 겪는다 bilin 발색단을 포함 . 이러한 변화를 바탕으로 24,27-29, 두 가지 광 흡수의가BphPs, 빨간색과 원적외선 광 흡수 상태 tates은 홍보 및 PFR로 표시. 홍보는 대부분의 BphPs에 대한 열 안정성, 어두운 적응 상태입니다. PR / PFR의 광 변환의 분자 기초가 완전히 때문에이 단백질의 제한 구조 지식을 이해하지 않습니다 28. D. 하나의 구조를 제외 radiodurans는, 이들 단백질의 번역 30 모두 X-선 결정 학적 구조가 어두운 상태에 적응하고 이펙터 도메인이 부족하다. 그대로 BphPs 효과적으로 핵 자기 공명 (NMR)에 의해 연구하기에는 너무 크고 X-선 결정학을위한 (특히 광 적응 상태에서) 그들의 본래 형태로 결정화 악명 어렵다. BphPs은 최근 적외선 형광 단백질 마커로 설계되었다 (IFP의).이 단백질의 31 구조 특성이 적용 IFP 디자인 지원을 촉진 할 수 있습니다. 32-36
이 기사의 초점은하는 절차를 제시하는 것PF-QNM 통해 액체 셀 AFM을 이용 BphPs의 촬상. 방법은 광합성 세균에서 R. bacteriophytochrome의 RpBphP3 (P3)의 광 적응 상태의 연구에 의해 증명된다 palustris. 여기에 제시된 AFM 절차는 단백질의 이미징을위한 편리하고 간단한 방법뿐만 아니라 다른 생물학적 거대 분자이다. 이 방법으로, 개별 분자의 구조적인 세부 사항은 상위 과학 과정 실험실 세션 유사한 시간의 단기간에 수집 할 수있다. 단면을 측정하고 상기 차원 분석을 통해 완료, 실험 데이터는 유용한 계산 모델을 비교할 수있다. 37-42
Protocol
Representative Results
Discussion
AFM은 생리 학적 조건에서 중요한 단백질 및 다른 생체 고분자를 충분히 촬상 할 수있는 주사 탐침 현미경 방법이다. X-선 결정학 및 NMR 비교하여, AFM의 한 가지 제한은 동일한 해상도, 특히 측 방향 해상도를 달성 할 수 없다는 점이다. 모든 표면에 분자를 분석하는 AFM을 이용하면 데이터를 분석 할 때, 분자의 이미지 표면의 영향과 프로브도 고려되어야한다. 획득 된 이미지 프로브의 영향 Deconvoluti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NSF-MRI 프로그램 (CHE : 1229103)는 새로운 전자 제어 장치, 소프트웨어, 액체 세포 및 이중 AFM / STM을 조립하는 데 필요한 다른 장비의 구입 자금을 인정한다. 우리는 AFM 계측, 교육 및 영상에 대한 지원은 시카고 NSF-MRSEC 프로그램의 대학 (DMR-0820054)의 공용 시설을 인정하고 악기 시간 동안 재료 연구 시설 네트워크 (DMR은-0820054)에 의해 제공. 우리는 특히 우리의 캠퍼스에 필요한 장비를 가져 NSF-MRI 제안의 자금 전에 학생들을 환영 박사 Qiti 구오 박사 저스틴 Jureller, 교수 카 유 리 감사합니다. 소모품 공급을위한 여름 연구 학생 및 교직원에 대한 생활비 지원뿐만 아니라 제공하는 노스 이스턴 일리노이 대학에게 수여 : (P031C110157 ID) 우리는 제목 III STEM 기금에서 자금을 인정합니다. 마지막으로, 우리는 계속 악기 지원 및 R에 대한 허가를 브루 커 (Bruker) 나노, 주식을 인정PeakForce QNM의 메커니즘을 보여주는 플롯을 eproduce 및 자동 소프트웨어 업데이트를 설명하는 단어 ScanAsyst을 사용합니다.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog # | Comments |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | O4997-100 | |
| NaCl | Acros Organics | 7647-14-5 | |
| MgCl2 | Acros Organics | 7791-18-6 | |
| Multimode 8 AFM | Bruker-Nano | 492-008-011 | equipped with Nanoscope V controller and J scanner |
| Probe | Bruker-Nano | SNL-10, ScanAsyst-Fluid+ | |
| Tapping Mode Fluid Cell | Bruker-Nano | MTFML | |
| Mica V-4 Grade | SPI supplies | 1150503 | 25 x 25 x .26 mm |
| Sample support disk | nanoSurf | BT02236 | |
| Petri dish | Plasta-Medic, Inc. | 100 mm x 15 mm | |
| micropipettors | Denville Scientific | XL 3000i | |
| RpBphP3 | Prepared according to cited references | ||
| Nanoscope software | Bruker-Nano | ||
| Fiber Optic Light | Digital Instruments Inc. | F0-50 | |
| Pelco AFM Disc Gripper | Ted Pella Inc | 1668 | 12 mm |
| 1 ml syringe | McKesson | 102-ST1C | |
| Eppendorf tubes | Denville Scientific | C2171 | |
| The Pymol Molecular Graphic System v.1.5.0.1 | Schrodinger, LLC |
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