アン<em>エクスビボ</em>レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために
Summary
We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.
Abstract
負傷CNSの軸索が再生し、多くの場合、離れて、損傷部位から退避に失敗する。最初の損傷から免れる軸索は、後に二次的軸索変性を受けることができる。脊髄内の追加髄軸索投射の成長円錐の形成の欠如、再生、および損失が大幅に損傷後の神経学的回復を制限します。脊髄の髄軸索が傷害に応答するかを中央評価するために、我々は、軸索に黄色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスを用いたex vivoでの生活脊髄モデルとの運命を文書化するための焦点と再現性の高いレーザー誘起脊髄損傷を開発二光子励起タイムラプス顕微鏡を用いて軸索と時間をかけてミエリン（親油性蛍光色素ナイルレッド）。そのような急性の軸索損傷、軸索退縮、およびミエリン変性などの動的プロセスは、最高のリアルタイムで研究されている。しかし、挫傷ベースの怪我や運動アーチファクトの非焦点性質が遭遇in vivoでの脊髄撮影時の挑戦的な高解像度の顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化する。ここで説明するex vivoでの脊髄モデルは軸索腫脹、回転楕円体の形成、軸索切断し、リアルタイムでこれらの動的過程を研究するために有用なモデルを提供して腫れ周囲の軸索を含む臨床的に関連する挫傷/圧縮によって誘発される軸索の病態のいくつかの側面を模倣。このモデルの主な利点は、直接軸索と二次的損傷のメカニズムを傷つける主要侮辱間の区別を可能にする優れた時空間分解能である。直接灌流液入浴コードへの試薬の制御注入。環境環境（ 例えば、カルシウム、ナトリウムイオン、軸索損傷に対する既知の貢献者が、 生体内で操作することが不可能に近い）の正確な変化は、それらは可視化する機会を提供したように、マウスモデルも利点を提供遺伝的に同定された細胞集団および細胞内構造を操作します。ここでは、急性の軸索損傷のダイナミクスをキャプチャするためにマウスから住んで脊髄を分離して画像にする方法について説明します。
Introduction
軸索の変性は神経外傷、脳卒中、自己免疫、および神経変性疾患を含むいくつかの神経学的状態にまたがる罹患率の顕著な原因である。末梢神経系（PNS）、中枢神経系とは異なり（CNS）の軸索は、一度による内因性および外因性障壁（ すなわち、ミエリン変性時の瘢痕形成の間に生成され、遊離した軸索成長の阻害分子）1の両方に負傷再生する限られた能力を有している-7。これらの障害のいくつかは、広く調査されてきたが、CNS軸索変性を防ぐ頑強な軸索再生を促進し、機能的な連結的に復元することを目的とした治療的介入は、限定されるもので残る。
一度彼らの相馬から分離軸索は軸索腫脹、回転楕円体の形成及び（8にレビュー）最終的な断片化することを特徴とするウォーラー変性として知られている変性のステレオタイプのプロセスを経る。で対照的に、離断周辺軸索の細胞体との連続性に残る近切り株は、その端部に腫脹を形成し、バックランヴィエの最も近いノードに死亡した後、その後の軸索再生のために必要な成長円錐の形成、重要な前提条件を開始することができます9-11。対照的に、多くの中央軸索の軸索近位末端は、特徴的な「endbulbs」または後退電球を形成成長円錐を形成し、その代わりに離れて、それらが損傷した後に12〜15ヶ月のままで、損傷部位から後退させることができない。主要な軸索損傷に加えて、追加の軸索損傷/損失も大幅に最初の損傷から免れた軸索に発生する可能性があります。最初は免れる軸索のこの遅延軸索損失は、二次的軸索変性と呼ばれている。傷害にCNSの軸索のこの固有の応答は、機能的な軸索再生の脳や脊髄に達成するために、さらに困難な目標をレンダリングします。
haであるが軸索損傷（ 例えば、回転楕円体の形成、後退電球）のllmarksがよく、死後組織と軸索変性の実験モデルから特徴づけられている、これらの動的プロセスの根底にある分子メカニズムの解明が制限されています。これらの研究のほとんどは、本質的に時間をかけて、個々の軸索の応答を捕捉するために失敗した静的なエンドポイントでの観察に依存していた。しかし、外因的に軸索トレーサーは静的セクションから、ライブイメージング中の軸索の応答を解明する有用であった適用、遺伝的にコードされた軸索マーカーの可用性が大幅に蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで軸索を可視化する当社の能力を向上させた。実際、ケルシェンシュタイナーや同僚からの精液報告書は、第一脊髄の背側の列に自分の予想を送るニューロンのサブセットで緑色蛍光タンパク質をコードしてはThy1 -GFP-Sのマウスを用いたin vivoでの軸索変性と再生の直接的な証拠を提供したコード16。ライブイメージングは、2光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）を使用して接近し、関心のある細胞の遺伝的蛍光タンパク質標識は、軸索変性のような多くの多様な動的プロセスへの直接的な証拠と機構的洞察を提供し続けたCa 2+シグナル伝達、軸索再生、星状細胞生理学、ミクログリア生理学、傷害17-25への応答。
軸索とは対照的に、ほとんどリアルタイムで負傷ミエリン反応知られている。ミエリンは、PNSにおけるCNSおよびシュワン細胞におけるオリゴデンドロサイトによって生成され、維持白質の重要なコンポーネントです。ミエリンは、軸索の表面の99％を絶縁し、そうすることによって、最近Buttermore らによる審査、迅速かつ効率的な跳躍インパルス伝播をサポートする高抵抗、低容量保護カバーを提供しています。26。傷害に対するミエリンの動的応答をキャプチャするために、我々はソルバ、親油性を使う蛍光染料ナイルレッド27。この生体染色のソルバトクロミック特性は、物理化学的環境28,29に依存し、その発光スペクトルのスペクトルシフトを可能にする。これらの特性は、axomyelinic損傷のメカニズムへの洞察を得るために有用であり、適宜選択ダイクロイックおよび発光フィルターを用いて可視化またはスペクトル顕微鏡27を使用して解決することができる。例えば、ナイルレッドの発光スペクトルは、ブルーシフトなどの脂肪細胞と正常なCNSミエリン（発光ピーク〜580から590 nm）の27に見られるような極性の低い、脂質の豊富な環境である。対照的に、〜625nmの軸索として形成endbulbsであるこの生体染色色素の発光スペクトルのピークは、軸索立ち枯れ27を受ける。通常のミエリンに対するendbulbsで特異的にこれらのスペクトルシフトの基礎となる正確なメカニズムは不明であるが、このようなスペクトルの変化は、タンパク質の蓄積や組織崩壊につながる基礎となる変化を明らかにすることができる疎水性結合部位27の露出。
in vivoイメージングは、それらのネイティブ環境で脊髄軸索損傷のダイナミクスを観察するための究極の測定基準であるが、それは技術的に困難であり、かなりの外科専門知識を必要とし、多くの場合、実験の成果物（ 例えば、炎症や傷跡を導入することが脊柱を露出するために手術を繰り返す形成）。また、高価な機器は、多くの場合、顕微鏡対物レンズ下で無傷動物の懸濁液及び位置決めを可能にするために必要とされる。動物は慎重に、彼らは、流体が補充されることを確認するために、そして長引く麻酔をイメージングセッションに低酸素症の兆候がないことを確認するために、温かいまま確保するためにも監視する必要がある。軸索とミエリンは絶対生存したまま一定灌流および適切な酸素レベルを必要とする後者は非常に重要である。しかし、これは、しばしばin vivo研究ほとんどの報告または監視されていない日付。による心拍数及び（イソフルラン麻酔成体マウスの呼吸に加えて、動きアーチファクト：〜毎分300〜450ビート（BPM）は、97から98パーセントの酸素飽和度（通常レート〜632 BPM）および〜55-65呼吸を維持するために最適であるでも最速のレーザースキャンが避けられないこれらの動きを受けますように、生体内の脊髄イメージング中に発生した））は、それぞれ、（通常のレートは毎分〜163呼吸である）毎分30は、挑戦的な高解像度の蛍光顕微鏡を使用して、プライマリおよびセカンダリ軸索損傷応答を差別化するアーティファクト。移植可能な剛性椎フレームウィンドウと組み合わせる超共鳴スキャナの進歩は、覚醒動物におけるマウス脊髄のイメージングを可能にすることができるが、より速いスキャン時間が必然的に画質を劣化させる信号対雑音比を減少させる。 、現在、脳イメージングに使用脊髄イメージング技術の更なる改善は、これらの障害の多くを克服し、伊那によって導入ポテンシャル交絡を制限することができるdequate組織灌流、 例えば、31-33。
白質生理学および白質損傷のメカニズムについては知られていることの多くは、 インビトロまたは視神経、末梢神経、および脊髄白質34-41のストリップからの白質のエクスビボ調製物において使用して決定されている。これらの製剤は、彼らが環境要因で制御さの変化、薬剤や試薬の制御された適用、電気生理学を用いて機能の評価、および生体組織における軸索とミエリンの直接の蛍光顕微鏡観察を可能にするように白質傷害メカニズムの知識を進めるために続けている。しかし、脊髄後カラムストリップまたは腹側白質ストリップから軸索を観察するためにいくつかの以前のアプローチは、不可避的に密接に反対した軸索の応答に影響を与える可能性が除去段階で表面軸索を傷つける。上記の実験操作を活用し、VEのへの損傷を避けるため、それはコードの背側面の直接接触を防止するように、調査中のryの繊維は、我々は、ex vivoで頸髄モデルを使用する。このように、軟膜と隣接する表面的な脊柱軸索のアーキテクチャでは、単離の間生存可能で、非摂動残る。
損傷後の10+時間 – ここでは、それらが動的に最大8リアルタイムで局所損傷に反応するように、中央髄軸索の直接可視化を可能にする比較的単純なアプローチを説明します。レーザー誘起脊髄損傷（LiSCI）モデルが空間的に時間をかけて拘束されたままに原発巣（アブレーション部位）などの一次および二次軸索損傷メカニズムの間の区別を可能にします。オープンバス撮像チャンバは、治療的介入、試薬送達、および環境の操作にアクセス可能である。推定上のaxomyelinic保護剤は、迅速に組織プロセスを伴う長くて費用のかかる実験に対して直接観察によりリアルタイムで評価することができる、る、免疫染色、画像キャプチャ、および分析を区画ため、生きた動物で実験的なエージェントをテストする前に急性応答および保護の操作を評価するための有用な代理モデルを提供します。
Protocol
Representative Results
Discussion
私たちは、表面のイメージングex vivoでの脊髄髄軸索（ すなわち、GRACILE束）時間をかけて、プライマリとセカンダリの両方の有髄軸索変性の動的な進行を研究するためにレーザ誘起脊髄損傷と組み合わせる。 生体外イメージングの方法を説明脊髄は、そのような動きアーチファクトと長時間のイメージングセッション中実験者誘発性低酸素症の可能性として、in vivo</em…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
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