एक<em> पूर्व vivo</em> लेजर प्रेरित स्पाइनल कॉर्ड चोट मॉडल वास्तविक समय में axonal अध: पतन के तंत्र का आकलन करने के लिए
Summary
We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.
Abstract
घायल सीएनएस axons पुनर्जन्म और अक्सर दूर चोट साइट से इनकार करने के लिए असफल। प्रारंभिक चोट से बच axons बाद में माध्यमिक axonal अध: पतन से गुजरना कर सकते हैं। रीढ़ की हड्डी के भीतर विकास शंकु गठन, उत्थान, और अतिरिक्त मेलिनकृत axonal अनुमानों के नुकसान की कमी के कारण बहुत चोट के बाद न्यूरोलॉजिकल वसूली की सीमा। रीढ़ की हड्डी के मेलिनकृत एक्सोन चोट का जवाब कैसे केंद्रीय आकलन करने के लिए, हम के भाग्य दस्तावेज़ करने के लिए पीले रंग फ्लोरोसेंट axons में प्रोटीन और एक केंद्र और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लेजर प्रेरित रीढ़ की हड्डी में चोट है कि एक्सप्रेस ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग रीढ़ की हड्डी मॉडल रहने वाले एक पूर्व vivo विकसित दो photon उत्तेजना समय चूक माइक्रोस्कोपी का उपयोग axons और समय के साथ माइलिन (lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक नील लाल)। ऐसी तीव्र axonal चोट, axonal त्याग, और माइलिन अध: पतन के रूप में गतिशील प्रक्रियाओं का सबसे अच्छा वास्तविक समय में अध्ययन कर रहे हैं। हालांकि, कुचलन आधारित चोटों और आंदोलन कलाकृतियों की गैर फोकल प्रकृति का सामना करना पड़ाउच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी चुनौतीपूर्ण का उपयोग करते हुए प्राथमिक और माध्यमिक axonal चोट प्रतिक्रियाओं का फर्क में विवो रीढ़ की हड्डी इमेजिंग बनाने के दौरान। यहाँ वर्णित पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी मॉडल axonal सूजन, अंडाकार आकृति गठन, axonal transection, और वास्तविक समय में इन गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल उपलब्ध कराने सूजन पेरी-axonal सहित नैदानिक प्रासंगिक कुचलन / संपीड़न प्रेरित axonal विकृतियों के कई पहलुओं mimics। इस मॉडल का प्रमुख लाभ सीधे axons और माध्यमिक चोट तंत्र घायल कि प्राथमिक अपमान के बीच भेदभाव की अनुमति देता है कि उत्कृष्ट spatiotemporal संकल्प कर रहे हैं; सीधे perfusate स्नान की हड्डी को अभिकर्मकों के नियंत्रित अर्क; पर्यावरणीय परिवेश की सटीक परिवर्तन (जैसे, कैल्शियम, सोडियम आयनों, axonal चोट करने के लिए है, लेकिन असंभव के पास जाना जाता योगदानकर्ताओं विवो में हेरफेर करने के लिए); वे कल्पना करने के लिए एक अवसर प्रदान करते हैं और murine मॉडल भी एक लाभ प्रदान करते हैं औरआनुवंशिक रूप से पहचान सेल आबादी और subcellular संरचनाओं में हेरफेर। यहाँ, हम अलग-थलग करने और छवि चूहों से रहने वाले रीढ़ की हड्डी की तीव्र axonal चोट की गतिशीलता पर कब्जा करने के लिए कैसे का वर्णन।
Introduction
Axons की अध: पतन neurotrauma, स्ट्रोक, स्व-प्रतिरक्षित, और neurodegenerative रोगों सहित कई स्नायविक शर्तों फैले रुग्णता का एक प्रमुख कारण है। परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन), केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के विपरीत (सीएनएस) एक्सोन एक बार वजह से आंतरिक और बाह्य बाधाओं (यानी, माइलिन अध: पतन के दौरान निशान गठन के दौरान उत्पादन और मुक्त axonal विकास के लिए निरोधात्मक अणुओं) 1 दोनों को घायल पुनर्जीवित करने के लिए एक सीमित क्षमता है -7। इन बाधाओं के कई बड़े पैमाने पर पता लगाया गया है, जिसका उद्देश्य उपचारात्मक उपायों, सीएनएस axonal अध: पतन को रोकने के मजबूत axonal उत्थान को बढ़ावा देने, और कार्यात्मक connectively बहाल करने के लिए, सीमित रहते हैं।
एक बार उनके सोमा से अलग axons axonal सूजन, अंडाकार आकृति गठन और (8 में समीक्षा) अंतिम विखंडन की विशेषता है कि Wallerian अध: पतन के रूप में जाना अध: पतन का एक टकसाली प्रक्रिया से गुजरना। मेंइसके विपरीत, एक transected परिधीय अक्षतंतु की सोमा के साथ निरंतरता में रहता है कि समीपस्थ स्टंप, बाद में axonal उत्थान के लिए एक महत्वपूर्ण शर्त आवश्यक है, एक उसके अंत में सूजन रूपों वापस Ranvier के निकटतम नोड के लिए मर जाता है, और फिर विकास शंकु गठन आरंभ कर सकते हैं 9-11। इसके विपरीत, कई केंद्रीय axons की समीपस्थ axonal अंत, विशेषता "endbulbs" या त्याग बल्ब फार्म विकास शंकु फार्म, और इसके बजाय दूर वे चोट 12-15 के बाद महीने के लिए रहना जहां चोट की साइट से इनकार करने के लिए असफल। प्राथमिक axonal चोट के अलावा, अतिरिक्त axonal क्षति / हानि भी काफी हद तक प्रारंभिक चोट से बच रहे थे कि axons के लिए हो सकता है। शुरू में बख्शा axons की इस देरी axonal हानि के रूप में माध्यमिक axonal अध: पतन के लिए भेजा है। चोट के सीएनएस axons की यह निहित प्रतिक्रिया कार्यात्मक axonal उत्थान मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में प्राप्त करने के लिए एक और भी अधिक मुश्किल लक्ष्य प्रदान करता है।
हा यद्यपिaxonal चोट (जैसे, अंडाकार आकृति गठन, त्याग बल्ब) के llmarks अच्छी तरह से पोस्टमार्टम ऊतक और axonal अध: पतन की प्रयोगात्मक मॉडल से विशेषता किया गया है, इन गतिशील प्रक्रियाओं अंतर्निहित आणविक तंत्र की व्याख्या प्रतिबंधित कर दिया गया है। इन अध्ययनों के अधिकांश स्वाभाविक समय के साथ अलग-अलग axonal प्रतिक्रियाओं पर कब्जा करने में विफल रहा है कि स्थिर समापन बिंदु टिप्पणियों पर भरोसा किया। हालांकि exogenously axonal ट्रेसर स्थिर वर्गों से और लाइव इमेजिंग के दौरान axonal प्रतिक्रियाओं को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी किया गया है आवेदन किया है, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग axonal मार्कर की उपलब्धता प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग वास्तविक समय में axons कल्पना करने के लिए हमारी क्षमता में सुधार की बहुत गया है। दरअसल, Kerschensteiner और उनके सहयोगियों से एक लाभदायक रिपोर्ट पहले रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय कॉलम में उनके अनुमानों भेज कि न्यूरॉन्स के सबसेट में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन सांकेतिक शब्दों में बदलना है कि Thy1 -GFP-एस चूहों का उपयोग vivo में axonal अध: पतन और उत्थान के प्रत्यक्ष सबूत प्रदान कीकॉर्ड 16। , लाइव इमेजिंग दो फोटॉन लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी (TPLSM) का उपयोग दृष्टिकोण और ब्याज की कोशिकाओं के आनुवंशिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन लेबलिंग इस तरह के axonal अध: पतन, सीए 2 + संकेतन, axonal उत्थान, अस्थिकणिका शरीर क्रिया विज्ञान के रूप में कई विविध गतिशील प्रक्रियाओं में प्रत्यक्ष सबूत और यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए जारी microglial फिजियोलॉजी, और चोट 17-25 के जवाब।
एक्सोन के विपरीत, बहुत कम वास्तविक समय में चोट के माइलिन प्रतिक्रियाओं के नाम से जाना जाता है। मेलिन पीएन में सीएनएस और श्वान कोशिकाओं में oligodendrocytes द्वारा निर्मित और बनाए रखा सफेद पदार्थ का एक महत्वपूर्ण घटक है। मेलिन axons की सतह के 99% insulates और ऐसा करके हाल ही में Buttermore एट अल। 26 द्वारा समीक्षा तेजी से और कुशल ऊबड़-खाबड़ आवेग प्रचार का समर्थन करता है कि एक उच्च प्रतिरोध, कम समाई सुरक्षा कवर प्रदान करता है। हम solvatochromic, lipophilic उपयोग चोट के माइलिन के गतिशील प्रतिक्रिया पर कब्जा करने के लिएफ्लोरोसेंट रंजक नील लाल 27। इस महत्वपूर्ण दाग की solvatochromic गुण भौतिक-रासायनिक वातावरण 28,29 पर निर्भर है कि अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के वर्णक्रम पारियों अनुमति देते हैं। इन गुणों axomyelinic चोट के तंत्र में जानकारी हासिल करने के लिए उपयोगी होते हैं और उचित रूप से चयनित dichroics और उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कल्पना या वर्णक्रमीय माइक्रोस्कोपी 27 का उपयोग कर हल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नील लाल उत्सर्जन स्पेक्ट्रम नीली स्थानांतरित कर दिया ऐसे adipocytes और सामान्य सीएनएस माइलिन (पीक उत्सर्जन ~ 580-590 एनएम) 27 में पाए जाने वाले के रूप में कम ध्रुवीय, लिपिड युक्त वातावरण में है। इसके विपरीत, ~ 625 एनएम axons के रूप में गठन किया endbulbs में इस महत्वपूर्ण डाई का उत्सर्जन स्पेक्ट्रम चोटियों axonal dieback 27 से गुजरना। सामान्य माइलिन बनाम endbulbs में विशेष रूप से इन वर्णक्रमीय पारियों अंतर्निहित सटीक तंत्र अस्पष्ट रहते हैं हालांकि, इस तरह के वर्णक्रमीय परिवर्तन प्रोटीन संचय या गड़बड़ी करने के लिए अग्रणी में अंतर्निहित परिवर्तन प्रकट हो सकता हैहाइड्रोफोबिक बाध्यकारी साइटों 27 का जोखिम।
Vivo इमेजिंग में उनके पैतृक वातावरण में रीढ़ की हड्डी axonal चोट गतिशीलता के अवलोकन के लिए परम मीट्रिक है, यह तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है और पर्याप्त शल्य विशेषज्ञता की आवश्यकता है, और अक्सर (जैसे, सूजन और निशान प्रयोगात्मक कलाकृतियों परिचय हो सकता है कि पृष्ठीय स्तंभ को बेनकाब करने के लिए सर्जरी दोहराने गठन)। इसके अलावा, महंगे उपकरण अक्सर माइक्रोस्कोप उद्देश्य लेंस के तहत एक अक्षुण्ण जानवर के निलंबन और स्थिति की अनुमति देने की जरूरत है। जानवरों को ध्यान से वे तरल पदार्थ मंगाया हैं सुनिश्चित करने के लिए, और की वजह से लंबे समय तक anesthetized इमेजिंग सत्र के लिए हाइपोक्सिया के कोई संकेत नहीं हैं सुनिश्चित करने के लिए, गर्म रहना सुनिश्चित करने के लिए के रूप में अच्छी तरह से नजर रखी जा करने की जरूरत है। axons और माइलिन बिल्कुल व्यवहार्य रहने के लिए निरंतर छिड़काव और पर्याप्त ऑक्सीजन स्तर की आवश्यकता के रूप में बाद अत्यंत महत्वपूर्ण है। हालांकि, इस बार सूचित किया या करने के लिए vivo अध्ययन में अधिकांश में निगरानी नहीं कर रहा हैतारीख। इसके अलावा, के कारण हृदय गति और साँस लेने के लिए आंदोलन कलाकृतियों (isoflurane वयस्क माउस anesthetized: ~ मिनट प्रति 300-450 धड़कता है (बीपीएम) 97-98% ऑक्सीजन संतृप्ति (सामान्य दर ~ 632 बीपीएम) और बनाए रखने के लिए इष्टतम है ~ 55-65 साँस न्यूनतम प्रति अनिवार्यत: इन आंदोलन के अधीन हैं, क्रमशः)) के रूप में 30 भी तेजी से लेजर स्कैन को चुनौती देने के लिए उच्च संकल्प प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग प्राथमिक और माध्यमिक axonal चोट प्रतिक्रियाओं का फर्क में विवो रीढ़ की हड्डी इमेजिंग बनाने के दौरान सामना (सामान्य दर ~ 163 मिनट प्रति साँस है) कलाकृतियों। जाग जानवरों में murine रीढ़ की हड्डी के इमेजिंग अनुमति दे सकता है एक implantable कठोर वर्टिब्रल फंसाया खिड़की के साथ संयुक्त ultrafast के गुंजयमान स्कैनर के क्षेत्र में अग्रिम, लेकिन तेजी से स्कैन बार अनिवार्य रूप से शोर अनुपात अपमानजनक छवि गुणवत्ता के लिए संकेत को कम। जैसा कि वर्तमान में मस्तिष्क इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया रीढ़ की हड्डी इमेजिंग तकनीक में और सुधार के लिए इन बाधाओं में से कई पर काबू पाने और आईएनए द्वारा शुरू की संभावित घालमेल सीमित कर सकता हैdequate ऊतक छिड़काव, जैसे, 31-33।
सफेद पदार्थ शरीर विज्ञान और सफेद पदार्थ चोट के तंत्र के बारे में जाना जाता है की ज्यादातर विट्रो या ऑप्टिक तंत्रिका, परिधीय तंत्रिका, और रीढ़ की हड्डी सफेद पदार्थ 34-41 के स्ट्रिप्स से सफेद पदार्थ की पूर्व vivo तैयारी में उपयोग करके निर्धारित किया गया है। वे पर्यावरणीय कारकों में परिवर्तन, जीवित ऊतक में ड्रग्स और अभिकर्मकों के नियंत्रित आवेदन, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का उपयोग कर कार्यात्मक आकलन, और axons की प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी टिप्पणियों और माइलिन नियंत्रित अनुमति के रूप में इन तैयारियों सफेद पदार्थ चोट तंत्र की हमारे ज्ञान अग्रिम जारी है। फिर भी, कुछ पिछले दृष्टिकोण अनिवार्यत: बारीकी से विरोध किया axons की प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं कि हटाने चरण के दौरान सतह एक्सोन घायल रीढ़ की हड्डी पृष्ठीय स्तंभ स्ट्रिप्स या उदर सफेद पदार्थ स्ट्रिप्स से axons के निरीक्षण करने के लिए। ऊपर दिए गए प्रयोगात्मक जोड़तोड़ को भुनाने और ve को नुकसान से बचने के लिएयह हड्डी के पृष्ठीय पहलू के सीधे संपर्क रोकता के रूप में जांच के तहत RY फाइबर, हम एक पूर्व vivo ग्रीवा रीढ़ की हड्डी मॉडल का उपयोग करें। इस प्रकार, पिया मेटर और आसन्न सतही पृष्ठीय स्तंभ axons की वास्तुकला अलगाव के दौरान व्यवहार्य और बेफिक्र रहते हैं।
चोट के बाद 10 + घंटा – यहाँ हम वे गतिशील करने के लिए 8 वास्तविक समय में एक केंद्र चोट का जवाब के रूप में केंद्रीय मेलिनकृत axons की प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है कि एक अपेक्षाकृत सरल दृष्टिकोण का वर्णन है। लेजर प्रेरित रीढ़ की हड्डी की चोट (LiSCI) मॉडल स्थानिक समय के साथ विवश रहता प्राथमिक घाव (पृथक साइट) के रूप में प्राथमिक और माध्यमिक axonal चोट तंत्र के बीच भेदभाव की अनुमति देता है। खुले स्नान इमेजिंग कक्ष चिकित्सकीय हस्तक्षेप, अभिकर्मक वितरण, और पर्यावरण जोड़तोड़ के लिए सुलभ है। ख्यात axomyelinic सुरक्षात्मक एजेंट जल्दी ऊतक प्रक्रिया से जुड़े लंबा और महंगा प्रयोगों बनाम प्रत्यक्ष टिप्पणियों द्वारा वास्तविक समय में मूल्यांकन किया जा सकताआईएनजी, इसलिए, immunostaining, छवि पर कब्जा, और विश्लेषण सेक्शनिंग और जीवित पशुओं में प्रयोगात्मक एजेंटों के परीक्षण से पहले तीव्र प्रतिक्रियाएं और सुरक्षात्मक जोड़तोड़ का आकलन करने के लिए एक उपयोगी सरोगेट मॉडल प्रदान करता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम की सतह की इमेजिंग पूर्व vivo रीढ़ की हड्डी मेलिनकृत एक्सोन (यानी, gracile पुलिका) समय के साथ दोनों को प्राथमिक और माध्यमिक मेलिनकृत axonal अध: पतन के गतिशील प्रगति का अध्ययन करने के लिए एक लेजर प्रेरित रीढ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates – Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.
Materials
| Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Large bath chamber with slice supports | Warner Instruments | RC-27L | For ex vivo imaging chamber |
| Standard Slice Supports | Warner Instruments | SS-3 | For ex vivo imaging chamber |
| Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers | Warner Instruments | SHD-27LP/10 | For ex vivo imaging chamber |
| Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed | Warner Instruments | ST-1L | For ex vivo imaging chamber |
| Solution In-line heater/cooler | Warner Instruments | SC-20 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | CL-100 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Liquid Cooling System | Warner Instruments | LCS-1 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Cable assembly for heater controllers | Warner Instruments | CC-28 | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Replacement bead thermisitor for CC-28 cable | Warner Instruments | TS-70B | To regulate perfusate temperature during imaging |
| Magnetic holder with suction tubing | Bioscience Tools | MTH-S | To hold the stainless steel vacuum suction tubing |
| Adjustable holder | Bioscience Tools | MTH | To hold the temperature probe |
| clear silicone sealant | For ex vivo imaging chamber | ||
| superglue | For ex vivo imaging chamber | ||
| thin plexiglass strips | For ex vivo imaging chamber | ||
| nile red | Life Technologies | N-1142 | For labeling myelin |
Riferimenti
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog Brain Res. 201, 253-294 (2012).
- Eva, R., Andrews, M. R., Franssen, E. H., Fawcett, J. W. Intrinsic mechanisms regulating axon regeneration: an integrin perspective. Int Rev Neurobiol. 106, 75-104 (2012).
- McCall, J., Weidner, N., Blesch, A. Neurotrophic factors in combinatorial approaches for spinal cord regeneration. Cell Tissue Res. 349, 27-37 (2012).
- Pernet, V., Schwab, M. E. The role of Nogo-A in axonal plasticity, regrowth and repair. Cell Tissue Res. 349, 97-104 (2012).
- Bradbury, E. J., et al. Chondroitinase ABC promotes functional recovery after spinal cord injury. Nature. 416, 636-640 (2002).
- Cregg, J. M., et al. Functional regeneration beyond the glial scar. Exp Neurol. 253, 197-207 (2014).
- Park, K. K., et al. Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science. 322, 963-966 (2008).
- Coleman, M. P., Freeman, M. R. Wallerian degeneration, wld(s), and nmnat. Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).
- Sulaiman, W., Gordon, T. Neurobiology of peripheral nerve injury, regeneration, and functional recovery: from bench top research to bedside application. Ochsner J. 13, 100-108 (2013).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 13, 183-193 (2012).
- Erturk, A., Hellal, F., Enes, J., Bradke, F. Disorganized microtubules underlie the formation of retraction bulbs and the failure of axonal regeneration. J Neurosci. 27, 9169-9180 (2007).
- Seif, G. I., Nomura, H., Tator, C. H. Retrograde axonal degeneration ‘dieback’ in the corticospinal tract after transection injury of the rat spinal cord: a confocal microscopy study. J Neurotrauma. 24, 1513-1528 (2007).
- Fishman, P. S., Mattu, A. Fate of severed cortical projection axons. J Neurotrauma. 10, 457-470 (1993).
- McPhail, L. T., Stirling, D. P., Tetzlaff, W., Kwiecien, J. M., Ramer, M. S. The contribution of activated phagocytes and myelin degeneration to axonal retraction/dieback following spinal cord injury. Eur J Neurosci. 20, 1984-1994 (2004).
- Stirling, D. P., et al. Minocycline treatment reduces delayed oligodendrocyte death, attenuates axonal dieback, and improves functional outcome after spinal cord injury. J Neurosci. 24, 2182-2190 (2004).
- Kerschensteiner, M., Schwab, M. E., Lichtman, J. W., Misgeld, T. In vivo imaging of axonal degeneration and regeneration in the injured spinal cord. Nat Med. 11, 572-577 (2005).
- Kalb, J., Nielsen, T., Fricke, M., Egelhaaf, M., Kurtz, R. In vivo two-photon laser-scanning microscopy of Ca2+ dynamics in visual motion-sensitive neurons. Biochem Biophys Res Commun. 316, 341-347 (2004).
- Hirase, H., Qian, L., Bartho, P., Buzsaki, G. Calcium dynamics of cortical astrocytic networks in vivo. PLoS Biol. 2, 96 (2004).
- Fenrich, K. K., Weber, P., Rougon, G., Debarbieux, F. Long- and short-term intravital imaging reveals differential spatiotemporal recruitment and function of myelomonocytic cells after spinal cord injury. J Physiol. 591, 4895-4902 (2013).
- Canty, A. J., et al. In-vivo single neuron axotomy triggers axon regeneration to restore synaptic density in specific cortical circuits. Nat Commun. 4, 2038 (2013).
- Dibaj, P., et al. NO mediates microglial response to acute spinal cord injury under ATP control in vivo. Glia. 58, 1133-1144 (2010).
- Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169, 1-7 (2008).
- Nimmerjahn, A. Two-photon imaging of microglia in the mouse cortex in vivo. Cold Spring Harb Protoc. 2012, (2012).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308, 1314-1318 (2005).
- Davalos, D., et al. Fibrinogen-induced perivascular microglial clustering is required for the development of axonal damage in neuroinflammation. Nat Commun. 3, 1227 (2012).
- Buttermore, E. D., Thaxton, C. L., Bhat, M. A. Organization and maintenance of molecular domains in myelinated axons. J Neurosci Res. 91, 603-622 (2013).
- Stirling, D. P., et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 137, 707-723 (2014).
- Greenspan, P., Fowler, S. D. Spectrofluorometric studies of the lipid probe, nile red. J Lipid Res. 26, 781-789 (1985).
- Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, 965-973 (1985).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011, (2011).
- Tajima, Y., et al. Cerebral hemodynamic response to acute hyperoxia in awake mice. Brain Res. 1557, 155-163 (2014).
- Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80, 900-913 (2013).
- Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. Motor behavior activates Bergmann glial networks. Neuron. 62, 400-412 (2009).
- Tsutsui, S., Stys, P. K. Metabolic injury to axons and myelin. Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).
- Matute, C., Ransom, B. R. Roles of white matter in central nervous system pathophysiologies. ASN Neuro. 4, (2012).
- Matute, C. Calcium dyshomeostasis in white matter pathology. Cell Calcium. 47, 150-157 (2010).
- Stys, P. K., Lipton, S. A. White matter NMDA receptors: an unexpected new therapeutic target. Trends Pharmacol Sci. 28, 561-566 (2007).
- Baltan, S. Surviving anoxia: a tale of two white matter tracts. Crit Rev Neurobiol. 18, 95-103 (2006).
- Stirling, D. P., Stys, P. K. Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation. Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).
- Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues. Biophys J. 89, 581-591 (2005).
- Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration. J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).
- Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons. J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).
- Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons. Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).
