Quantification simultanée de T-Cell Receptor Cercles excision (TREC) et cercles K-Suppression recombinaison Excision (KRECs) par PCR en temps réel
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
Cercles d'excision du récepteur des cellules T (TREC) et des cercles recombinaison excision K-suppression (KRECs) sont de petits éléments d'ADN circularisées qui sont excisés dans une proportion de lymphocytes T et les cellules B, respectivement, au cours d'un processus de recombinaison d'ADN génomique, ce qui conduit à la formation d'un répertoire très diversifié de récepteurs T et cellules B. Ils ne ont aucune fonction, mais parce qu'ils sont stables et ne peuvent être reproduites, elles sont diluées après chaque division cellulaire, ainsi que la persistance dans l'une des deux cellules filles. Par conséquent, les niveaux dans le sang périphérique peuvent être considérées comme une estimation de la production de la moelle osseuse et le thymus.
Bien que le dosage TREC a été largement utilisé au cours des 15 dernières années pour évaluer l'ampleur de la production thymique, une KREC le dosage, qui a été initialement développé pour mesurer la prolifération des lymphocytes B et sa contribution à l'homéostasie des lymphocytes B dans la santé et la maladie, 2 a été récemment proposé comme marqueur de l'os mflèche sortie. 3,4 Ici, nous décrivons la méthode que nous avons développé pour la quantification simultanée des deux TREC et KRECs. 4
Avec cette méthode combinée, la variabilité associée à la quantification de l'ADN par PCR en temps réel est éliminé par l'utilisation d'une courbe standard unique, obtenue par dilution d'un plasmide à triple insert contenant des fragments de TREC, KRECs et récepteur de cellules T alpha constant (TCRAC) gène dans un rapport de 1: 1: 1. Cela permet une évaluation plus précise du nombre de copies TREC et KREC. De plus, la quantification simultanée des deux cibles dans la même réaction permet de réduire les coûts de réactifs.
Le dosage TREC / KREC proposé peut être utile de mesurer l'ampleur de T et cellules B néo-production chez les enfants ou adultes avec déficit immunitaire combiné sévère (SCID), 4 immunitaire commun variable, 5 maladies auto-immunes, 6-8 et l'infection à VIH . 9 En outre, il peut être utilisé poursurveiller le rétablissement immunitaire après greffe de cellules souches hématopoïétiques, 10 le remplacement de l'enzyme, 11 et antiviral 9 ou immunomodulateurs thérapies. 8.6 Enfin, parce que les patients SCID sont comptabilisées en utilisant un dosage TREC malgré les défauts génétiques sous-jacentes, et une agammaglobulinémie patients peuvent être identifiés en utilisant KREC quantification , le dosage TREC / KREC peut également être utilisé pour détecter immunodéficiences dans les programmes de dépistage néonatal. 12 Dans ce cas, le test doit être effectué sur l'ADN extrait de petites taches de sang effacé et séché sur du papier filtre, doit être hautement sensible et spécifique pour les maladies cibles, ainsi que les très reproductible et rentable.
L'introduction de KREC quantification dans le test devrait améliorer les performances de dépistage néonatal de déficits immunitaires, qui a régulièrement été effectuées dans les certaines parties des Etats-Unis (WI, MA, CA) depuis 2008 quand le Wisconsin est devenu le premier à Introduce l'analyse de TREC dans son programme de dépistage postnatal. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Riferimenti
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