Simultane Quantifizierung von T-Zell-Rezeptor-Excision Kreis (TRECs) und K-Löschen Rekombination Excision Kreis (KRECs) durch Echtzeit-PCR
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
T-Zell-Rezeptor-Exzision Kreise (TRECs) und K-Löschen Rekombination Exzision Kreise (KRECs) sind kleine zirkularisiertes DNA-Elemente, die in einem Anteil von T- und B-Zellen jeweils während einer genomischen DNA-Rekombination herausgeschnitten werden, was zu dem Bildung einer stark diversifizierten Repertoire von T- und B-Zell-Rezeptoren. Sie haben keine Funktion, sondern weil sie stabil sind und nicht repliziert werden, werden sie nach jeder Zellteilung verdünnt, also nur in einer der beiden Tochter persistierenden Zellen. Daher kann ihre Ebenen im peripheren Blut als eine Schätzung des Thymus und des Knochenmarks Ausgangs angenommen werden.
Während die TREC-Assay wurde weitgehend in den letzten 15 Jahren um das Ausmaß der Thymusfunktion auszuwerten, um 1 der KREC Assay, die ursprünglich entwickelt wurde B-Zell-Proliferation und ihren Beitrag zur B-Zell-Homöostase in Gesundheit und Krankheit, 2 messen wurde erst kürzlich als Marker der Knochen m vorgeschlagenenarrow Ausgang. 3,4 Hier beschreiben wir die Methode, die wir für die simultane Quantifizierung von beiden TRECs und KRECs entwickelt. 4
Mit diesem kombinierten Verfahren wird die Variabilität DNA Quantifizierung durch Echtzeit-PCR verbunden sind, durch die Verwendung eines einzigartigen Standardkurve durch Verdünnung einer Triple-Insert enthaltenden Plasmid Fragmente TRECs, KRECs und T-Zell-Rezeptor alpha konstant erhalten (TCRAC) beseitigt Gens in einer 1: 1: 1-Verhältnis. Dies ermöglicht eine genauere Bewertung der TREC und KREC Kopienzahl. Ferner ist die gleichzeitige Quantifizierung der zwei Targets in der gleichen Reaktion ermöglicht Reagenz Kostenreduzierung.
Die vorgeschlagene TREC / KREC Assay kann nützlich sein, um das Ausmaß der T- und B-Zell-neo-Produktion bei Kindern oder Erwachsenen mit schwerer kombinierter Immundefizienz (SCID), 4 Common Variable Immunodeficiency, 5 Autoimmunerkrankungen, 6-8 und HIV-Infektionen zu messen Ferner. 9 zeigt, kann es verwendet werdenÜberwachung der Immun Erholung nach Transplantation hämatopoetischer Stammzellen, 10 Enzymersatz, 11 und antivirale 9 oder immunmodulierende Therapien. 6-8 Schließlich weil SCID-Patienten werden mit TREC-Test trotz der zugrunde liegenden genetischen Defekte erkannt und Agammaglobulinämie Patienten können mit KREC Quantifizierung identifiziert werden Die TREC / KREC Assay kann auch verwendet werden, um Immun in Neugeborenen-Screening-Programme erkennen. 12 In diesem Fall muss der Test an aus kleinen Flecken von Blut abgetupft extrahierten DNA durchgeführt, und auf Filterpapier getrocknet werden müssen hochempfindlich und spezifisch für sein die Zielkrankheiten, sowie in hohem Maße reproduzierbar und kostengünstig.
Die Einführung KREC Quantifizierung im Test sollte Aufführungen von Neugeborenen-Screening für Immundefekte, die routinemäßig in den einigen Teilen der USA (WI, MA, CA) seit 2008 durchgeführt wurde, zu verbessern, wenn Wisconsin war der erste, um introduce die Analyse TRECs in seiner postnatale Screening-Programm. 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Riferimenti
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