टी सेल रिसेप्टर छांटना सर्किलों के एक साथ मात्रा (TRECs) और कश्मीर हटाने पुनर्संयोजन छांटना हलकों (KRECs) वास्तविक समय पीसीआर द्वारा
Summary
Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.
Abstract
T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.
Introduction
टी सेल रिसेप्टर छांटना हलकों (TRECs) और कश्मीर को हटाने पुनर्संयोजन छांटना हलकों (KRECs), एक जीनोमिक डीएनए पुनर्संयोजन प्रक्रिया के दौरान टी और क्रमश: बी-कोशिकाओं, के अनुपात में excised हैं कि छोटे circularized डीएनए तत्व हैं करने के लिए अग्रणी एक उच्च विविध टी के प्रदर्शनों की सूची और बी सेल रिसेप्टर्स के गठन। वे कोई कार्य किया है, लेकिन वे स्थिर हैं और नहीं दोहराया जा सकता है, क्योंकि वे इस प्रकार केवल दो बेटी कोशिकाओं में से एक में बने, प्रत्येक कोशिका विभाजन के बाद पतला कर रहे हैं। इसलिए, परिधीय रक्त में इनकी मात्रा Thymic और अस्थि मज्जा उत्पादन के एक अनुमान के रूप में माना जा सकता है।
TREC परख काफी हद तक Thymic उत्पादन की हद तक मूल्यांकन करने के लिए पिछले 15 वर्षों से इस्तेमाल किया गया है, जबकि शुरू में विकसित किया गया था, जो एक KREC परख, बी सेल प्रसार और स्वास्थ्य और रोग में बी-सेल समस्थिति के लिए अपने योगदान, 2 को मापने के लिए हाल ही में हड्डी मीटर की एक मार्कर के रूप में प्रस्तावित किया गया हैउत्पादन तीर। 3,4 यहाँ, हम हम TRECs और KRECs दोनों के एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए विकसित की विधि का वर्णन। 4
इस संयुक्त विधि के साथ, वास्तविक समय पीसीआर द्वारा डीएनए मात्रा का ठहराव के लिए जुड़े परिवर्तनशीलता TRECs, KRECs और टी सेल रिसेप्टर अल्फा निरंतर के टुकड़े से युक्त एक ट्रिपल डालने प्लाज्मिड गिराए द्वारा प्राप्त एक अद्वितीय मानक वक्र के उपयोग (TCRAC) से सफाया कर दिया है 1: 1 के अनुपात में एक 1 में जीन। इस TREC और KREC प्रतिलिपि संख्या का एक और अधिक सटीक मूल्यांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एक ही प्रतिक्रिया में दो लक्ष्यों के एक साथ मात्रा का ठहराव अभिकर्मक लागत में कमी की अनुमति देता है।
प्रस्तावित TREC / KREC परख गंभीर संयुक्त इम्यूनो (SCID), 4 आम चर इम्यूनो, 5 autoimmune रोग, 6-8 और एचआईवी संक्रमण के साथ बच्चों या वयस्कों में टी की हद और बी सेल नव उत्पादन को मापने के लिए उपयोगी हो सकता है 9। इसके अलावा, यह करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैरोगियों KREC मात्रा का ठहराव का उपयोग कर पहचाना जा सकता है agammaglobulinemia SCID रोगियों अंतर्निहित आनुवंशिक दोषों के बावजूद TREC परख का उपयोग कर मान्यता प्राप्त कर रहे हैं, क्योंकि अंत में। 6-8 hematopoietic स्टेम कोशिका प्रत्यारोपण, 10 एंजाइम प्रतिस्थापन, 11 और एंटीवायरल 9 या immunomodulating उपचारों के बाद प्रतिरक्षा वसूली की निगरानी, और , TREC / KREC परख भी नवजात स्क्रीनिंग कार्यक्रमों में immunodeficiencies का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। 12 इस मामले में, परीक्षण रक्त मिट के छोटे धब्बे से निकाले डीएनए पर प्रदर्शन किया और फिल्टर पेपर पर सूख जाना चाहिए, अत्यधिक संवेदनशील और के लिए विशिष्ट होना चाहिए लक्ष्य रोगों, साथ ही अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लागत प्रभावी है।
विस्कॉन्सिन introduc करने के लिए पहली बन गया जब परीक्षा में KREC मात्रा का ठहराव की शुरूआत नियमित तौर पर 2008 के बाद से संयुक्त राज्य अमेरिका (WI, एमए, सीए) के कुछ भागों में प्रदर्शन किया गया है जो immunodeficiencies के लिए नवजात स्क्रीनिंग, के प्रदर्शन में सुधार करना चाहिएअपने प्रसव के बाद स्क्रीनिंग कार्यक्रम में TRECs के ई विश्लेषण। 13
Protocol
Representative Results
Discussion
TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Histopaque-1077 | Sigma Aldrich SRL | 10771-500 ML | density gradient separation method |
| QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) | QIAGEN | 51106 | DNA extraction |
| Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080156 | |
| GeneAmp dNTP Blend (100 mM) | Applied Biosystems/Life-Technologies | N8080261 | |
| TOPO TA Cloning Kit for Subcloning | Invitrogen/Life-Technologies | K4500-01 | |
| XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells | Stratagene | 200130 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| SpeI 500U | New England Biolabs | R0133S | |
| HindIII-HF 10,000 U | New England Biolabs | R3104S | |
| PureYield Plasmid Midiprep System | Promega | A2492 | |
| XhoI 5,000 U | New England Biolabs | R0146S | |
| TRIS Utrapure | Sigma Aldrich SRL | T1503 | |
| EDTA | Sigma Aldrich SRL | E5134 | |
| TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA) | |||
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4364338 | |
| Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol | Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l | Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl | |
| NanoDrop 2000c spectrophotometer | ThermoFisher | ||
| Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems/Life-Technologies | 4359659 | |
| Fast 7500 Real-Time PCR system | Applied Biosystems/Life-Technologies | ||
| SDS Sequence Detection Software 1.4 | Applied Biosystems/Life-Technologies |
Riferimenti
- Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
- Zelm, M. C., Szczepanski, T., van der Burg, M., van Dongen, J. J. M. Replication history of B lymphocytes reveals homeostatic proliferation and extensive antigen-induced B cell expansion. J. Exp. Med. 204 (3), 645-655 (2007).
- Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
- Sottini, A., et al. Simultaneous quantification of recent thymic T-cell and bone marrow B-cell emigrants in patients with primary immunodeficiency undergone to stem cell transplantation. Clin. Immunol. 136 (2), 217-227 (2010).
- Serana, F., et al. Thymic and bone marrow output in patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 31 (4), 540-549 (2011).
- Zanotti, C., et al. Opposite effects of interferon-β on new B and T cell release from production sites in sclerosis. J. Neuroimmunol. 240-241, 147-150 (2011).
- Zanotti, C., et al. Peripheral accumulation of newly produced T and B lymphocytes in natalizumab-treated multiple sclerosis patients. Clin. Immunol. 145 (1), 19-26 (2012).
- Sottini, A., et al. Pre-existing T- and B-cell defects in one progressive multifocal leukoencephalopathy patient. PLoS One. 7, e34493 (2012).
- Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
- Mensen, A., et al. Utilization of TREC and KREC quantification for the monitoring of early T- and B-cell neogenesis in adult patients after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J. Transl. Med. 11, 188 (2013).
- Serana, F., et al. The different extent of B and T cell immune reconstitution after hematopoietic stem cell transplantation and enzyme replacement therapies in SCID patients with adenosine deaminase deficiency. J. Immunol. 185 (12), 7713-7722 (2010).
- Borte, S., et al. Neonatal screening for severe primary immunodeficiency diseases using high-throughput triplex real-time PCR. Blood. 119 (11), 2552-2555 (2012).
- Baker, M. W., et al. Implementing routine testing for severe combined immunodeficiency within Wisconsin’s newborn screening program. Public Health Rep. 125 (2), 88-95 (2010).
- Lorenzi, A. R., et al. Determination of thymic function directly from peripheral blood: a validated modification to an established method. J. Immunol. Meth. 339 (2), 185-194 (2008).
- De Boer, R. J., Perelson, A. S. Quantifying T lymphocyte turnover. J. Theor. Biol. 327, 45-87 (2013).
