Summary

T 세포 수용체 절제술 원의 동시 정량 (TRECs)와 K-삭제 재조합 절제술 원 (KRECs) 실시간 PCR에 의한

Published: December 06, 2014
doi:

Summary

Here, we describe a method for simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs). The TREC/KREC assay can be used as marker of thymic and bone marrow output.

Abstract

T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) are circularized DNA elements formed during recombination process that creates T- and B-cell receptors. Because TRECs and KRECs are unable to replicate, they are diluted after each cell division, and therefore persist in the cell. Their quantity in peripheral blood can be considered as an estimation of thymic and bone marrow output. By combining well established and commonly used TREC assay with a modified version of KREC assay, we have developed a duplex quantitative real-time PCR that allows quantification of both newly-produced T and B lymphocytes in a single assay. The number of TRECs and KRECs are obtained using a standard curve prepared by serially diluting TREC and KREC signal joints cloned in a bacterial plasmid, together with a fragment of T-cell receptor alpha constant gene that serves as reference gene. Results are reported as number of TRECs and KRECs/106 cells or per ml of blood. The quantification of these DNA fragments have been proven useful for monitoring immune reconstitution following bone marrow transplantation in both children and adults, for improved characterization of immune deficiencies, or for better understanding of certain immunomodulating drug activity.

Introduction

T 세포 수용체 절제 원 (TRECs) 및 K-삭제 재조합 절제 원 (KRECs)는 게놈 DNA 재조합 과정 T- 각각 B-세포의 비율로 절제되어 작은 원형으로 DNA 요​​소이다 선도 매우 다양한 레퍼토리의 T- 및 B- 세포 수용체의 형성. 이들은 어떤 기능이 없지만, 그들이 안정되고 복제 될 수 없기 때문에, 따라서 그들은 단지 두 개의 딸 세포 중 하나로 지속 각 세포 분열 후에 희석된다. 따라서, 말초 혈액에서의 수준은 흉선 및 골수의 출력 추정값으로서 가정 될 수있다.

TREC 분석은 주로 흉선 출력의 정도를 평가하기 위해 지난 15 년 동안 사용되었지만, 초기에 개발 된 1 KREC 분석은 B 세포의 증식 및 건강과 질환에서의 B 세포의 항상성에 기여 2 측정 최근 골 m의 마커로서 제안되었다출력 화살표. 3,4 여기, 우리는 우리가 TRECs과 KRECs 모두의 동시 정량을 위해 개발 된 방법을 설명합니다. (4)

이 조합 된 방법으로, 실시간 PCR에 의해 DNA 정량 연관된 가변성 TRECs, KRECs 및 T 세포 수용체 알파 상수의 단편을 함유하는 트리플 삽입 플라스미드를 희석 한 고유의 표준 곡선을 사용 (TCRAC)에 의해 제거된다 1 : 1 : 1 비율의 유전자. 이것은 TREC와 KREC 카피 수의 더 정확한 평가를 할 수있다. 또한, 동일한 반응에서 두 타겟의 동시 정량 시약 비용 감소를 허용한다.

제안 된 TREC / KREC 분석은 중증 복합 면역 결핍 (SCID), 4 공통 변수 면역 결핍, 5자가 면역 질환, 6-8과 HIV 감염 어린이 또는 성인의 T-의 범위와 B 세포 신 생산을 측정하기 위해 유용 할 수 있습니다 . (9) 또한,이 사용 가능환자 KREC 정량화를 사용하여 식별 될 수 agammaglobulinemia SCID 환자 근본적인 유전 적 결함에도 불구 TREC 분석법을 인식하고 있기 때문에, 최종적. 6-8, 조혈 줄기 세포 이식, 10 효소 대체 (11)와 바이러스 9 또는 면역 요법 후에 면역 회수를 모니터링하고, , TREC / KREC 분석은 또한 신생아 스크리닝 프로그램에서 immunodeficiencies를 검출하는데 사용될 수있다. (12)이 경우, 시험 혈액 도말의 작은 반점에서 추출한 DNA에 대해 수행하고 여과지상에서 건조되어야 고도로 민감하고 특이이어야 표적 질환뿐만 아니라 재현성이 높은 비용 효율적인.

위스콘신부터 소개하는 첫번째되었을 때 시험에 KREC 정량의 도입은 일상적으로 2008 미국 (WI, MA, CA)의 일부 지역에서 수행 된 immunodeficiencies에 대한 신생아 선별 검사의 성능을 개선한다그 산후 검진 프로그램에 TRECs의 전자 분석. (13)

Protocol

참고 : 윤리 문 :이 프로토콜은 우리의 기관, Spedali Civili 디 브레시아의 지침을 다음과 "트리플 삽입"플라스미드 1. 준비 선택 및 적절한 출발 물질의 제조 : 이러한 EDTA 튜브에 수집 젊은 건강한 피사체의 말초 혈액으로 PCR에 의해 검출 TRECs과 KRECs을 발생할 가능성이 매우 높습니다 세포를 포함하는 샘플을 얻습니다. 주 : 원래 우리 KRECs위한 편도선 ?…

Representative Results

분석은 87 건강한 대조군의 대표 샘플에서 수행 하였다 : (42) 어린이는 0 세 – 17 (남성 / 여성 : 17분의 25)와 24 세 (45) 성인 – 60 (남성 / 여성 : 16분의 29)을. 결과를 계산 하였다 TRECs 10 6 PBMC 당 KRECs 후 혈액 1 ㎖ 당과 TRECs KRECs로서 수득 하였다. 4 년 – TRECs의 수는 인해 0-3 매우 날카로운 방식으로 특히 흉선 퇴화, 4 세 감소한다. 그것은 여성보다 남성에게 더 빠르게 ?…

Discussion

TREC and KREC quantification can be considered a good estimate of recent thymic and bone marrow output provided that some caveats are taken into account. Even though an absolute quantification method employing standard curve requires more reagents and more space on the real-time PCR reaction plate, it ensures highly accurate quantitative results because unknown sample quantities are interpolated from standard curves built upon known amounts of starting material. Moreover this method is better fitted to detect low amount …

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Histopaque-1077 Sigma Aldrich SRL 10771-500 ML density gradient separation method
QIAamp DNA Blood Mini Kit (250) QIAGEN 51106 DNA extraction
Unmodified DNA Oligonucleotides HPSF 0.01 mmol Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
AmpliTaq DNA Polymerase: including 10x Buffer II and 25mM MgCl2 Applied Biosystems/Life-Technologies N8080156
GeneAmp dNTP Blend (100 mM) Applied Biosystems/Life-Technologies N8080261
TOPO TA Cloning Kit for Subcloning Invitrogen/Life-Technologies K4500-01
XL1-Blue Subcloning Grade Competent Cells Stratagene 200130
PureYield Plasmid Miniprep System Promega A1223
SpeI 500U New England Biolabs R0133S
HindIII-HF 10,000 U New England Biolabs R3104S
PureYield Plasmid Midiprep System Promega A2492
XhoI 5,000 U New England Biolabs R0146S
TRIS Utrapure Sigma Aldrich SRL T1503
EDTA Sigma Aldrich SRL E5134
TE buffer (1 mM TRIS and 0.1 mM EDTA)
TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems/Life-Technologies 4364338
Dual labeled probes HPLC 0.01 mmol Eurofins MWG Operon/Carlo Erba Reagents S.r.l  Resuspend the lyophilized product to 100 picmol/µl
NanoDrop 2000c spectrophotometer ThermoFisher
Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler Applied Biosystems/Life-Technologies 4359659
Fast 7500 Real-Time PCR system Applied Biosystems/Life-Technologies
SDS Sequence Detection Software 1.4 Applied Biosystems/Life-Technologies

Riferimenti

  1. Douek, D. C., et al. Changes in thymic function with age and during the treatment of HIV infection. Nature. 396 (6712), 690-695 (1998).
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  3. Fronkova, E., et al. B-cell reconstitution after allogeneic SCT impairs minimal residual disease monitoring in children with ALL. Bone Marrow Transplant. 42 (3), 187-196 (2008).
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  9. Quiros-Roldan, E., et al. Effects of combined antiretroviral therapy on B- and T-cell release from production sites in long-term treated HIV-1+ patients. J. Transl. Med. 10, 94 (2012).
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Citazione di questo articolo
Sottini, A., Serana, F., Bertoli, D., Chiarini, M., Valotti, M., Vaglio Tessitore, M., Imberti, L. Simultaneous Quantification of T-Cell Receptor Excision Circles (TRECs) and K-Deleting Recombination Excision Circles (KRECs) by Real-time PCR. J. Vis. Exp. (94), e52184, doi:10.3791/52184 (2014).

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