Хирургический метод Виралли опосредованной доставки генов к мыши внутреннего уха через круглое окно мембраны

Summary

The described post-auricular surgical approach allows rapid and direct delivery into the mouse cochlear scala tympani while minimizing blood loss and animal mortality. This method can be used for cochlear therapy using molecular, pharmacologic and viral delivery to postnatal mice through the round window membrane.

Abstract

Генная терапия, используются для достижения функционального восстановления от нейросенсорной глухотой, обещает предоставить лучшее понимание основных молекулярных и генетических механизмов, которые способствуют потере слуха. Введение векторов во внутреннее ухо должно быть сделано таким образом, что широко распределяет агента в улитке при сведении к минимуму повреждение к существующим структурам. Эта рукопись описывает пост-предсердного хирургического подхода, который может быть использован для мыши кохлеарного терапии с использованием молекулярного, фармакологические, и вирусную доставку в постнатальный день мышей 10 лет и старше через мембрану круглого окна (РВМ). Это хирургический подход позволяет быстро и прямую доставку в барабанную лестницу, минимизируя потерю крови и избежать гибели животных. Этот метод включает незначительное или никакое повреждение к основным структур внутреннего и среднего уха, а также мышц шеи, а полностью сохраняя слух. Чтобы продемонстрировать эффективность этой хирургической техники, везикулярного glutamели транспортер 3 нокаутом (VGLUT3 КО) мышей будет использоваться в качестве примера модели мыши врожденной глухотой, что восстанавливает слуха после доставки VGLUT3 во внутреннее ухо с помощью аденоассоциированный вирус (AAV-1).

Introduction

Генная терапия уже давно было предложено в качестве потенциального лечения для генетического потери слуха, но успех в этой области остается неуловимым ^1. На сегодняшний день, вирусно опосредованные методики преобладали из-за теоретической возможности ориентироваться на конкретные типы клеток в относительно недоступном улитки. Оба аденовируса (AV) и аденоассоциированный вирус (AAV) были использованы для доставки генов кохлеарного. AAVs имеют то преимущество, улитки для целого ряда причин. Они репликации с дефицитом вирусы и могут эффективно передавать трансгенных молекулы различных типов клеток, включая нейроны, важной мишенью для ряда причин потери слуха. Запись AAV в клетке опосредованы специфическими рецепторами ^2; Таким образом, выбор конкретного серотипа должны быть совместимы с типами клеток, чтобы быть трансдуцированных. AAVs может эффективно трансфекции клетки волос ^3, и включить в геном хозяина, в результате чего в стабильном, долгосрочном выражения траnsgenic белка и фенотипическая изменение в клетке ^4. Хотя это и не обязательно выгодно для краткосрочного применения, таких как регенерация волос клеток, долговременные выражение очень важно для стабильной спасения генетических дефектов. Потому что AAVs не связаны с какой-либо человеческой болезни или инфекции и не демонстрируют ототоксичность ^5,6,7, они являются идеальным кандидатом для использования в генной терапии для унаследованных форм потери ⁸ слуха.

Передача экзогенного генетического материала в млекопитающих внутреннее ухо с помощью вирусных векторов изучалась на протяжении последнего десятилетия, и становится перспективным методом лечения и генетических и приобретенных форм потери ⁹ слуха. Улитка потенциально идеальной мишенью для генной терапии по нескольким причинам: 1) его небольшой объем требует ограниченное количество вируса необходимо; 2) его относительная изоляция от других ограничений системы органов побочных эффектов; и 3) его заполненные жидкостью камеры облегчить вируснойдоставка по всей лабиринта ^{10, 11,12,13,14, 15.}

Мышиные модели врожденной глухоты позволяют использовать многие методы исследования, чтобы следить за развитием внутреннего уха в систематическом, воспроизводимого образом. В то время как небольшой размер мыши cochleae действительно представляет некоторые хирургические трудности, мышь служит чрезвычайно важной моделью в изучении генетического потери слуха, с нескольких экспериментальных преимуществ по сравнению с другими видами ^16. Мышиные модели позволяют оценить диапазоне характеристик с помощью генной анализа сцепления, сбор подробных морфологических наблюдений, и, имитирующей патогенные сценарии; как таковые, они являются хорошими кандидатами для вирусно опосредованного генной терапии. Обширные генетические исследования на мышах в сочетании с технологическими достижениями сделали возможным для создания генетически модифицированных мышей в воспроизводимым образом между лабораториями ^{17,18, 19, 20,21.} Furthermorе, существует множество моделей как для приобрел и унаследовал слуха фенотипы потери у мышей, что позволяет тщательное тестирование в этом животной модели ^{22, 23,24.} Таким образом, исправление слух с помощью вирусно-опосредованного генной терапии в мышиной модели является целесообразным первым шагом в поисках лекарства от болезни человека.

Ранее мы показали, что трансгенные мыши, лишенные везикулярного глутамата транспортер 3 (VGLUT3) рождаются глухими из-за отсутствия высвобождения глутамата в IHC ленте Synapse ^25. Поскольку эта мутация не приводит к первичной дегенерации волосковых клеток, эти мутантные мыши являются потенциально отличный модель, в которой для проверки кохлеарный генной терапии для врожденной потерей слуха.

На сегодняшний день количество вирусных методов доставки для генной терапии кохлеарный были описаны, в том числе круглого окна мембраны диффузии, круглый инъекции окно мембраны и доставки через cochleostomy. Есть мощныйМВЛ преимущества и недостатки каждого из этих подходов ^9.

Мы сообщаем хирургический метод вирусом опосредованной доставки генов во внутреннее ухо VGLUT3 КО мышей через мембрану круглого окна (РВМ). После ушной метод РВМ инъекции минимально инвазивной с превосходной сохранности слуха, и относительно быстро. Как мы уже ранее опубликованы, в попытке восстановить слух в этой модели мыши, вектор AAV1, несущий ген VGLUT3 (AAV1-VGLUT3) была введена в улитку этих глухих мышей в постнатальный день 12 (P @), в результате чего восстановление слуха ^26. Услышав у мышей VGLUT3 KO была проверена слухового ответа ствола мозга (ABR), в то время как трансгенная экспрессия белка была проверена с помощью иммунофлюоресценции (ИФ). Таким образом, это методология показывает, что вирусно-опосредованного генной терапии может исправить генетический дефект, который бы в противном случае приводит к глухоте.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры и животные обращение соблюдены NIH этических принципов и утвержденных требований Протокола к уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Калифорнии, Сан-Франциско. 1. Подготовка животных для хирургии Провод…

Representative Results

Для проверки технических характеристик и полезность пост-ушной подхода к кохлеарной молекулярной терапии, AAV1-VGLUT3, AAV1-GFP и AAV2-GFP были доставлены в P10-12 мышей внутреннего уха через РВМ. Такой подход демонстрирует успешную экспрессию трансгена во внутренних волосковых клеток (IHC) (VGLUT3 Р?…

Discussion

В этой работе, мы подробно описать метод, который может быть использован для генной терапии кохлеарный, с целью восстановления нормального или спасение слуховой функции, которая снижена в результате генетического дефекта. Как правило атравматической, этот подход является безопасным ?…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Butler Schein
Xylazine	AnaSed
Acepromazine	Provided by UCSF LARC
Carprofen analgesia	Provided by UCSF LARC
Betadine	Betadine Puredue Pharma
dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex)	Alcon
Heating pad	Braintree scientific, inc.
25G needle	BD	305127
Borosilicate capillary pipette	World precision instruments, inc.	1B100F-4
Suture PDS*plus Antibacterial	Ethicon	PDP149
Tissue glue (Vetcode)	Butler Schein	31477
Rabbit Anti-GFP antibody	Invitrogen	A11122
Dissecting microscope	Leica		MZ95
Flaming/ Brown Micropipette	Sutter Instrument Co
Puller Model P-97
TDT BioSig III System	Tucker-Davis Technologies