Haut Débit Fluorometric Technique pour l'évaluation de phagocytose des macrophages et l'actine polymérisation
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
Le but de l'analyse fluorométrique est de servir en tant que, rentable, à haut débit méthode efficace d'analyse de la phagocytose et d'autres processus cellulaires. Cette technique peut être utilisée sur une variété de types cellulaires, aussi bien adhérentes et non adhérentes, pour examiner diverses propriétés cellulaires. Lorsque l'on étudie la phagocytose, la technique fluorométrique utilise des types de cellules phagocytaires telles que les macrophages et les particules marquées par fluorescence opsonisées dont la fluorescence peut être éteint en présence de bleu trypan. Après plaquage des macrophages adhérentes dans des plaques à 96 puits, particules fluorescentes (vert ou rouge) sont administrés et les cellules sont autorisés à phagocyter pour des montants variés de temps. À la suite de l'internalisation des particules fluorescentes, les cellules sont lavées avec du bleu trypan, ce qui facilite l'extinction de signal fluorescent à partir de bactéries qui ne sont pas internalisées, ou sont simplement adhérant à la surface des cellules. Après le lavage de trypan, les cellules sont lavées avec du PBS, fixés, une colorées avec DAPI (label bleu fluorescent nucléaire), qui sert à étiqueter les noyaux des cellules. Par une quantification fluorométrique simples grâce à la lecture de la plaque de l'énergie nucléaire (bleu) ou de particules (/ vert rouge) fluorescence nous pouvons examiner le rapport des unités de fluorescence relative de vert: bleu et de déterminer un indice phagocytaire indicatif de quantité de bactéries fluorescentes intériorisées par cellule. La durée de l'essai en utilisant un procédé et multicanaux à 96 puits pour le lavage des pipettes, de la fin de la phagocytose à la fin de l'acquisition de données, est inférieur à 45 min. La cytométrie en flux peut être utilisé d'une manière similaire, mais l'avantage de la fluorométrie est son débit élevé, méthode rapide d'évaluation avec un minimum de manipulation d'échantillons et la quantification rapide de l'intensité de fluorescence par cellule. Des stratégies similaires peuvent être appliqués à des cellules non adhérentes, des bactéries vivantes, marqués polymérisation de l'actine, et essentiellement tout procédé utilisant la fluorescence. Par conséquent, fluorométrie est une méthode prometteuse pour son faible coût, haute throughpcapacités ut dans l'étude des processus cellulaires.
Introduction
La quantification de signal fluorescent a été largement utilisé dans une multitude de méthodes scientifiques allant de PCR, cytométrie en flux, la microscopie confocale, et l'analyse FRET à multiplexer ELISA. imagerie de fluorescence et la quantification a une application large et peut être un excellent outil pour l'analyse quantitative de divers processus cellulaires. L'utilisation de marqueurs fluorescents et leur signal a été révolutionné dans la dernière décennie, et l'émergence des lecteurs de plaques à fluorescence a facilité la quantification à haut débit de la fluorescence émise lors de processus cellulaires.
Analyse fluorométrique peut servir comme un excellent outil pour la quantification de la phagocytose. Phagocytose a été étudié depuis la découverte des phagocytes par Metchnikoff en 1800 1. Au fil des ans, une variété de méthodes ont été utilisées pour examiner cet important processus essentiel pour la défense immunitaire innée contre l'invasion bactérienne, virale, fongique et les agents pathogènes parasitaires 2-5. Les méthodes antérieures de quantification utilisé la microscopie et techniques stéréologiques afin de visualiser les cellules qui sont phagocytose, qui ont ensuite été quantifiés par comptage des particules internalisées (manuellement ou avec l'utilisation de logiciels) 6-8. Certains inconvénients à utiliser la microscopie seule pour l'analyse quantitative sont que le comptage manuel des bactéries est beaucoup de travail et plus enclins à biais de l'observateur. Une autre méthode utilisée dans la quantification de la phagocytose est la technique de placage microbiologique des bactéries à partir de lysats cellulaires (ci-après phagocytose) sur des plaques de culture bactérienne, mais cette méthode peut ne pas tenir compte des mécanismes bactéricides et la présence de bactéries internalisées partiellement. Cette méthode est encore plus de main-d'œuvre par rapport à la microscopie et prend plusieurs jours à analyser. Débit semble cytométrie être le moyen le plus rapide, le plus efficace pour quantifier la phagocytose et a été utilisé par de nombreux groupes de 9 à 11, mais le coût élevé généralement associé avec le auinstrument nécessaire pour l'analyse rend le procédé plus coûteux, par rapport aux tests mentionnés précédemment.
La méthode fluorométrique est une bonne alternative à la cytométrie en flux pour l'analyse de l'internalisation de particules, car il offre la quantification objective de l'équipement de fluorescence à l'aide qui ne est pas que le coût prohibitif. Autres avantages supplémentaires de fluorométrie sont à haute efficacité, et les capacités à haut débit permettant de quantifier la fluorescence émise par les particules internalisées étiquetés.
Avantages de fluorométrie peuvent être extrapolés à la quantification des processus autres que la phagocytose. Par exemple, l'analyse fluorométrique peut être appliqué à étudier tout processus conduisant à des changements dans l'expression des récepteurs intracellulaires ou membranaires, les changements dans la perméabilité cellulaire / viabilité, l'efficacité de transfection, et la modulation dans la polymérisation de l'actine. Un inconvénient de la technique fluorométrique est que, selon les étiquettes utilisées, il peut y avoir une forteune expérience à la variabilité qui peut habituellement être résolu en démontrant données par quantification relative, comme le changement de pli ou pour cent d'augmentation du contrôle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les principales limites de la technique fluorométrique sont variance expérimentale ainsi que la perte de cellules associé à un lavage extensif et l'utilisation de cellules non adhérentes.
La variance est observée principalement en raison de la variation de particules fluorescentes que la pesée et pipetage lors de la préparation de la solution mère ne est pas une manière exacte de maintenir numéros identiques de particules d'une expérience à. Pour résoudre le problème d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
Riferimenti
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