High Throughput Fluorometrisk Teknik for Vurdering af makrofag Fagocytose og actinpolymerisation

Summary

Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.

Abstract

Målet med fluorometrisk analyse er at tjene som en effektiv, omkostningseffektiv, high throughput fremgangsmåde til analyse af fagocytose og andre cellulære processer. Denne teknik kan anvendes på en række celletyper, både adhærente og ikke-adhærente, at undersøge en række cellulære egenskaber. Når man studerer fagocytose fluorometrisk teknik udnytter fagocytiske celletyper såsom makrofager og fluorescensmærkede opsoniseret partikler, hvis fluorescens kan slukkes i nærvær af trypanblåt. Efter udpladning af adhærente makrofager i 96-brønds plader, fluorescerende partikler (grøn og rød) administreres og cellerne får lov til at fagocytere til forskellige mængder af tid. Efter internalisering af fluorescerende partikler vaskes cellerne med trypan blåt, hvilket letter udryddelse af fluorescerende signal fra bakterier, som ikke er internaliseret, eller blot klæber til celleoverfladen. Efter trypan vask vaskes cellerne med PBS, fikseret, ennd farvet med DAPI (nuklear blåt fluorescerende mærke), der tjener til at mærke kernerne i celler. Ved en simpel fluorometrisk kvantificering gennem plade læsning af nukleart (blå) eller partikel (rød / grøn) fluorescens vi kan undersøge forholdet mellem relative fluorescensenheder grøn: blå og bestemme en fagocytisk indeks indikerer mængden af ​​fluorescerende bakterier internaliserede per celle. Varigheden af ​​analysen ved hjælp af en 96-brønds metode og multikanalpipetter til vask, fra slutningen af ​​fagocytose til slutningen af ​​dataopsamling, er mindre end 45 min. Flowcytometri kan anvendes på en lignende måde, men fordelen ved fluorometri er dens høje gennemløb, hurtig metode til vurdering med minimal manipulation af prøver og hurtig kvantificering af fluorescensintensitet pr celle. Lignende strategier kan anvendes til ikke-adhærente celler, levende mærkede bakterier, actinpolymerisation og i det væsentlige enhver proces udnytter fluorescens. Derfor fluorometri er en lovende fremgangsmåde til lave omkostninger, høj throughput kapaciteter i studiet af cellulære processer.

Introduction

Kvantificering af fluorescerende signal har været meget anvendt i en lang række videnskabelige metoder spænder fra PCR, flowcytometri, konfokal mikroskopi og FRET analyse til at multiplex ELISA. Fluorescensimagografi og kvantificering har en bred anvendelse og kan være et godt værktøj til kvantitativ analyse af forskellige cellulære processer. Anvendelse af fluorescerende markører og deres signal er blevet revolutioneret i det sidste årti, og fremkomsten af ​​fluorescerende pladelæsere har lettet high throughput kvantificering af fluorescens udsendt under cellulære processer.

Fluorometrisk analyse kan tjene som et godt værktøj i kvantificering af fagocytose. Fagocytose blev undersøgt siden opdagelsen af fagocytter af Metchnikoff i 1800 ^1. I årenes løb har en række forskellige metoder blevet anvendt til at undersøge denne vigtige proces afgørende for medfødte immunsystem forsvar mod invaderende bakterie-, virus-, svampe- og parasitære patogener ^2-5. Tidligere metoder til kvantificering anvendes mikroskopi og stereologiske teknikker med henblik på at visualisere celler, der er fagocytose, som derefter blev kvantificeret ved at tælle internaliserede partikler (manuelt eller ved brug af software) ^6-8. Nogle ulemper ved at bruge mikroskopi alene til kvantitativ analyse er, at manuel optælling af bakterier er arbejdskrævende og mere tilbøjelige til observatør bias. En anden metode, der anvendes i kvantificering af fagocytose er den mikrobiologiske teknik udpladning af bakterier fra cellelysater (efter fagocytose) på bakteriekultur plader, men denne metode kan ikke redegøre for baktericide mekanismer og tilstedeværelse af delvist internaliserede bakterier. Denne fremgangsmåde er endnu mere arbejdskrævende i forhold til mikroskopi og tager adskillige dage at analysere. Flowcytometri synes at være den hurtigste, mest effektive måde at kvantificere fagocytose og er blevet udnyttet af mange grupper ^9-11, men de høje omkostninger ofte forbundet med den istrument nødvendig for analysen gør det dyreste metode i forhold til de tidligere nævnte assays.

Den fluorometriske metode er et godt alternativ til flow-cytometri til analyse af partikel internalisering da det giver unbiased kvantificering af fluorescens under anvendelse af udstyr, der ikke er så omkostningerne uoverkommelige. Andre ekstra fordele af fluorometri er høj effektivitet, og høj kapacitet til at kvantificere fluorescens udsendt af de mærkede internaliserede partikler.

Fordele ved fluorometri kan ekstrapoleres til kvantificering af andre end fagocytose processer. For eksempel kan anvendes fluorometrisk analyse til at studere enhver proces, der fører til ændringer i ekspression af intracellulære eller membranbundne receptorer, ændringer i cellepermeabilitet / levedygtighed transfektion effektivitet og modulation i actinpolymerisation. En ulempe ved fluorometrisk teknik er, at, afhængigt af de anvendte etiketter, kan der være en højeksperiment til eksperiment variation der kan normalt løses ved at demonstrere data via relativ kvantificering, såsom fold ændring eller procent stigning fra kontrol.

Protocol

BEMÆRK: Denne protokol kan bruges til flere applikationer såsom kvantificering af fagocytose og actinpolymerisation som bruges i vores tidligere offentliggjorte arbejde 12. Protokollen egner sig til en lang række ændringer og tabel 1 lister celletyper og partikler med held anvendt i tidligere undersøgelser. Standard brug af denne protokol til kvantificering af fagocytose eller actinpolymerisation er illustreret i diagram 1. <p class="jove_content" fo:keep-together.wi…

Representative Results

To store måder at kvantificere fagocytose og den efterfølgende actinpolymerisation ved brug af denne protokol er at observere kontinuerlig eller synkroniseret fagocytose. Mikroskopisk analyse (figur 1B) illustrerer fluorescerende billeder svarende til hvad fluorometer optager (se også Diagram 1). I figur 1B er røde fluorescens af actin, grøn 268 fluorescens af FITC etiketter HKOP E. coli, nuklear DAPI pletten, og det flettede b…

Discussion

Store begrænsninger af fluorometriske teknik er eksperimentelle varians samt celletab forbundet med omfattende vask og brug af ikke-adhærente celler.

Varians observeres i høj grad skyldes variationen i fluorescerende partikler som vejning og pipettering under forberedelsen af ​​stamopløsningen er ikke en eksakt måde at opretholde ens antal partikler fra eksperiment til eksperiment. For at løse problemet med variansen mellem eksperimenter, kan data i relative tal, for eksempel som% …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres;	Molecular Probes	F8852	combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate	Molecular Probes	E2861	reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use
Opsonizing reagent	Molecular Probes	E2870
Rhodamine phalloidin	Molecular Probes	R415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Trypan blue	Gibco	15250-061
the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers
RPMI Cell growth media	Gibco		Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use
Fluorescent plate reader-Fluostar Omega	BMG Labtech
Paraformaldehyde (16%)	Fischer Scientific	AA433689M	dilute to 4% before use
96 well plates	Greiner	655097	clear or black or clear bottom – black plates
Multichannel pipette (8-12 channels)
Reagent reservoirs
1x PBS
Microfuge tubes (0.6 ml)
Conicles (10 ml)