High Throughput Fluorometric Technik zur Bewertung der Makrophagen-Phagozytose und Aktinpolymerisation
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
Das Ziel der fluorometrischen Analyse ist es, als eine effiziente, kosteneffektive und qualitativ Durchsatzverfahren zur Analyse von Phagozytose und andere zelluläre Prozesse dienen. Diese Technik kann auf einer Vielzahl von Zelltypen, sowohl adhärenten und nicht-adhärenten verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Eigenschaften zu untersuchen. Bei der Untersuchung von Phagozytose, fluorometrische Technik nutzt phagozytischen Zelltypen, wie Makrophagen und fluoreszenzmarkierten opsonierten Partikel, deren Fluoreszenz in Gegenwart von Trypanblau ausgelöscht werden. Nach Plattierung der adhärenten Makrophagen in 96-Well-Platten, fluoreszierenden Partikeln (grün oder rot) verwaltet und Zellen werden für unterschiedliche Zeitdauern zu phagozytieren. Nach Internalisierung von fluoreszierenden Teilchen, werden die Zellen mit Trypan-Blau, das Erlöschen des Fluoreszenzsignals von den Bakterien, die nicht internalisiert werden, oder lediglich an der Zelloberfläche anhaften erleichtert gewaschen. Nach dem Trypan Waschen werden die Zellen mit PBS gewaschen, fixiert, einnd mit DAPI (blau Atomfluoreszenzmarkierung), die Kerne von Zellen zu markieren dient gefärbt. Durch eine einfache fluorometrische Quantifizierung durch die Platte Lesen von Kern (blau) oder Partikel (rot / grün) Fluoreszenz können wir das Verhältnis der relativen Fluoreszenzeinheiten von grünen untersuchen: blau und bestimmen einen phagozytischen Index, der Menge an Fluoreszenz Bakterien verinnerlicht pro Zelle. Die Dauer des Assays unter Verwendung einer 96-Well-Verfahren und ein Mehrkanal-Pipetten zum Waschen, vom Ende der Phagozytose zu Ende der Datenerfassung, weniger als 45 min. Durchflußzytometrie könnte in ähnlicher Weise verwendet werden, aber der Vorteil der Fluorometrie ist seine hohe Durchsatz, schnelles Verfahren zur Beurteilung mit minimaler Manipulation von Proben und schnelle Quantifizierung der Fluoreszenzintensität pro Zelle. Ähnliche Strategien können zu nicht anhaftenden Zellen, Live-markierten Bakterien, Aktin-Polymerisation, und praktisch jedes Verfahren, bei dem Fluoreszenz angewendet werden. Daher ist Fluorometrie eine vielversprechende Methode wegen seiner geringen Kosten, hoher throughput-Fähigkeiten bei der Untersuchung von zellulären Prozessen.
Introduction
Quantifizierung der Fluoreszenzsignal wurde in großem Umfang in einer Vielzahl von wissenschaftlichen Methoden, die von PCR verwendet, Durchflusszytometrie, konfokale Mikroskopie und FRET-Analyse ELISA multiplexen. Fluoreszenz-Bildgebung und Quantifizierung hat eine breite Anwendung und kann ein großes Werkzeug für die quantitative Analyse von verschiedenen zellulären Prozessen sein. Verwendung von fluoreszierenden Markierungen mit Signal in den letzten zehn Jahren revolutioniert worden, und das Auftreten von Fluoreszenzplattenleser hat den hohen Durchsatz Quantifizierung der Fluoreszenz während zellulären Prozessen emittierten erleichtert.
Fluorometrische Analyse kann als großartiges Werkzeug in die Quantifizierung der Phagozytose zu dienen. Phagozytose wurde seit der Entdeckung durch Phagozyten Metchnikoff 1800 1 untersucht. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von Verfahren verwendet worden, um diese wichtige Prozess prüfen wesentlich für angeborene Immunabwehr gegen eindringende bakteriellen, viralen, Pilz- und parasitären Erregern 2-5. Bisherige Verfahren zur Quantifizierung genutzt Mikroskopie und stereoTechniken, um Zellen, die phagozytierenden werden, die dann durch Zählen von internalisierten Partikeln (manuell oder unter Verwendung von Software) 6-8 quantifiziert wurden visualisieren. Einige Nachteile der Verwendung Mikroskopie allein zur quantitativen Analyse sind, dass eine manuelle Auszählung der Bakterien ist arbeitsintensiv und anfällig für ein Vorurteil des Beobachters. Ein weiteres bei der Quantifizierung der Phagozytose verwendete Methode ist die mikrobiologische Verfahren der Plattierung von Bakterien aus Zelllysaten (folgenden Phagozytose) auf Bakterienkulturplatten, aber dieses Verfahren kann nicht für bakterizide Mechanismen und Gegenwart von partiell internalisierte Bakterien stellen. Diese Methode ist noch arbeitsintensiv im Vergleich zu Mikroskopie und dauert mehrere Tage, um zu analysieren. Durchfluss-Zytometrie scheint, um die schnellste und effektivste Weg, um Phagozytose zu quantifizieren und wurde von vielen Gruppen 9-11 verwendet worden, aber die hohen Kosten allgemein mit der im zugehörigenInstrument für die Analyse erforderlich macht es die teuerste Methode im Vergleich zu den zuvor genannten Assays.
Die fluorometrische Methode ist eine gute Alternative zu Zytometrie zur Analyse von Partikel Internalisierung fließen denn es bietet unvoreingenommene Quantifizierung der Fluoreszenz mit Hilfe von Geräten, die nicht so kostspielig. Andere zusätzlichen Vorteile der Fluorometrie sind hoher Wirkungsgrad und eine hohe Durchsatzvermögen zu quantifizieren Fluoreszenz von den markierten Partikeln emittierte internalisiert.
Vorteile der Fluorometrie kann Quantifizierung andere als Phagozytose Prozessen extrapoliert werden. Beispielsweise kann fluorometrische Analyse angewendet werden, um jeden Prozess, der auf Veränderungen in der Expression von intrazellulären oder membrangebundene Rezeptoren, Veränderungen in der Zelldurchlässigkeit / Lebensfähigkeit Transfektionseffizienz und Modulation in einer Aktin-Polymerisation zu untersuchen. Ein Nachteil der fluorometrischen Technik ist, dass, abhängig von den verwendeten Etiketten, es kann eine hoch seinExperiment, um die Variabilität in der Regel durch den Nachweis von Daten über relative Quantifizierung, wie fache Veränderung oder Prozent aus Steuer gelöst werden können, zu experimentieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hauptbeschränkungen der fluorometrischen Technik sind experimentelle Varianz sowie Zellverlust bei ausgiebigem Waschen und Verwendung von nicht-adhärenten Zellen assoziiert.
Varianz ist weitgehend durch die Variation der Fluoreszenzpartikeln als Wäge- und Pipettieren während der Herstellung der Stammlösung beobachtet keine genaue Möglichkeit der Beibehaltung identischer Teilchenzahlen von Experiment zu Experiment. Um das Problem der Abweichungen zwischen Experimenten befassen, können …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
Riferimenti
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