대 식세포 식균 작용과 액틴의 중합의 평가를위한 높은 처리량 형광 측정 기법
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
형광 분석의 목적 및 기타 탐식 세포 과정을 분석하는 효율적이고 비용 효과적인, 높은 처리량 방법으로 제공하는 것이다. 이 기술은 세포의 다양한 특성을 조사하기 위해, 점착성 및 비 점착성 세포 유형 모두의 다양한 이용 될 수있다. 식균 작용을 연구 할 때, 형광 기술은 대 식세포, 및 그 형광 트리 판 블루의 존재 하에서 소멸 될 수 형광 표지 된 입자로서 옵 소닌 포식성 세포 유형을 이용한다. 96 웰 플레이트, 형광 입자 (녹색 또는 빨간색)에 부착 된 대 식세포의 도금에 따라 투여하고 세포는 시간의 다양한 양의 탐식 할 수 있습니다. 형광 발색 입자의 내재화 후, 세포를 내재화되지 않거나 단지 세포 표면에 부착되는 박테리아로부터 형광 신호의 소멸을 촉진 트리 판 블루로 세척. 트리 판 세척 후, 세포를 고정, PBS로 세척하고,차 세포의 핵에 레이블을 제공 DAPI (핵 파란색 형광 라벨), 염색. 판 핵 (파란색)의 읽기 또는 입자를 통해 간단한 형광 정량 (적색 / 녹색) 형광 우리는 녹색의 상대 형광 단위의 비율을 검사 할 수 있습니다 : 파란색 셀 당 내면화 형광 박테리아의 양을 나타내는 식세포 인덱스를 결정합니다. 세척 96- 웰 방법 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 분석의 기간은, 데이터 취득 종료 탐식 단부로부터, 45 분 미만이다. 유동 세포 계측법 유사한 방식으로 사용하지만 형광 측정의 장점은 높은 처리량, 샘플들의 최소 조작 셀당 형광 강도를 빠르게 정량화 평가의 신속한 방법이다 될 수있다. 유사한 전략은 본질적으로 비 부착 성 세포를 살아있는 박테리아 표지 액틴 중합하고 형광을 이용하여 임의의 처리를 적용 할 수있다. 따라서, 형광 측정 낮은 비용, 높은 throughp 유망한 방법이다세포 과정의 연구에서 유타 기능을 제공합니다.
Introduction
형광 신호의 정량화 널리 유동 세포 계측법, 공 촛점 현미경, 및 ELISA를 다중화 분석을 FRET, PCR에 이르기까지 과학적인 방법의 군중에서 사용되어왔다. 형광 이미징 및 정량화 광범위한 응용 프로그램을 가지고 있으며, 다양한 세포 과정의 정량 분석을위한 훌륭한 도구가 될 수 있습니다. 형광 마커와 그 신호의 사용은 지난 10 년에 혁명되었고, 형광 플레이트 리더의 출현은 세포 과정 동안 방출되는 형광의 높은 처리량 정량화를 촉진했다.
형광 분석은 식균 작용의 정량화에 훌륭한 도구 역할을 할 수 있습니다. 탐식 1800 1 Metchnikoff 의한 식세포의 발견 이후로 검토되고있다. 몇 년 동안, 다양한 방법은 세균, 바이러스, 진균 및 기생충 병원균 2-5 침입에 대해 선천성 면역 방어에 필수적이 중요한 과정을 조사하기 위해 이용되어왔다. 순서대로 정량 활용 현미경 및 stereological 기술의 이전 방법은 다음 내면화 입자 (수동 또는 소프트웨어의 사용과) 6-8의 계산에 의해 정량화 된 것을 시사하고 있습니다 세포를 시각화합니다. 정량 분석 혼자 현미경을 사용하여 몇 가지 단점 박테리아의 수동 계산은 노동 집약적이고 관찰자 바이어스 경향이라고합니다. 식세포 작용의 정량화에 사용 된 또 다른 방법은 세균 배양 플레이트 상 (탐식 다음) 세포 용 해물로부터 세균의 미생물 도금 방법이지만,이 방법은 부분적으로 살균 메커니즘 내면화 박테리아의 존재를 고려하지 않을 수있다. 이 방법은 현미경에 비해 훨씬 더 노동 집약적이고 분석하는 데 몇 일이 소요됩니다. 유동 세포 계측법 탐식 정량화 가장 빠르고 효과적인 방법을 보인다 많은 그룹 9-11에 의해 이용되어 왔지만, 일반적으로 고비용에서와 연관된이전에 언급 된 분석법에 비해 분석에 필요한 strument는 가장 비싼 방법 만든다.
형광 방법은 엄청난 비용으로하지 형광 사용하여 장비의 편견 정량을 제공하기 때문에 입자 국제화의 분석을 위해 유동 세포 계측법 수있는 좋은 대안입니다. 형광 측정의 다른 추가적인 장점은 고효율 및 내재화 표지에 의해 방출 된 형광 입자를 정량 높은 처리 능력이다.
형광 측정의 장점은 식균 작용 이외의 프로세스의 정량화를 추정 할 수있다. 예를 들어, 형광 분석 액틴 중합 세포 또는 막 – 결합 수용체, 세포 투과성 / 생존력, 형질 전환 효능의 변화, 및 변조의 발현의 변화로 이어지는 모든 프로세스를 연구에 적용될 수있다. 형광 측정 기술의 한 가지 단점은 사용 된 레이블에 따라 하이가있을 수 있다는 것이다실험은 일반적으로 배 변경이나 컨트롤에서 % 증가로 상대적으로 정량화를 통해 데이터를 보여줌으로써 해결할 수 있습니다 변동성을 실험합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
형광 측정 기술의 주요 제한은 실험 분산뿐만 아니라 광범위한 세척 및 비 부착 세포의 사용과 관련된 세포의 손실이다.
분산이 때문에 원액의 제조 동안 계량 페팅 같은 형광 물질의 변화에 크게 관측된다 실험 실험에서 입자의 동일 번호를 유지하는 정확한 방법이 아니다. (-; 입자는 즉시 및 제거가 t = 0 제어) 실험 간의 편차의 문제를 해결하기 위해, 데이터는 % 탐식 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
Riferimenti
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