Makrofaj Fagositoz ve Aktin Polimerizasyon Değerlendirme Yüksek Verimli Florimetrik Tekniği
Summary
Here we present a protocol to quantify phagocytosis of fluorescent particles by adherent macrophage cell line using a fluorometric method. This method facilitates a high throughput quantification of particle internalization as well as the resulting actin polymerization.
Abstract
flüorometrik analiz amacı fagositozunu ve diğer hücresel süreçleri analiz verimli, düşük maliyetli, yüksek verim yöntemi olarak hizmet etmektir. Bu teknik, hücre çeşitli özelliklerini incelemek için, yapışkan ve yapışkan olmayan, her iki hücre tipinde, çeşitli kullanılabilir. Fagositozu okuyan zaman flüorometrik tekniği gibi makrofajlar ve kimin floresan tripan mavisi varlığında sönmüş olabilir floresan etiketli opsonize edilmiş parçacıklar gibi fagositik hücre tiplerini kullanır. 96 oyuklu plakalar, floresan parçacıkların (yeşil veya kırmızı) yapışkan makrofaj kaplama izlenerek tatbik edilmektedir ve hücreler, zaman çeşitli miktarlarda fagosite izin verilir. Floresan parçacıkların içselleştirme sonra hücreler içsel olmayan, ya da sadece hücre yüzeyine yapışan bakterilerden floresan sinyalin yok olmasına olanak tripan mavisi ile yıkanır. Tripan yıkamayı takiben, hücreler, sabit, PBS ile yıkanır, birnd hücrelerin çekirdekleri etiketlemek için hizmet veren DAPI (nükleer mavi floresan etiket) ile boyandı. Levha çekirdek (mavi) okunması ya da bir parçacık içinde basit bir florometrik miktar olarak (kırmızı / yeşil) floresans yeşil nispi floresan birimlerinin oranı inceleyebilir: mavi ve hücre başına içsel floresan bakteri miktarının göstergesi olan bir fagositik endeksinin belirlenmesi. yıkama için 96 çukurlu bir yöntem ve çok kanallı pipet kullanılarak tahlil süresi, veri toplama sonuna fagositoz sonundan, 45 dakikadan daha azdır. Akış sitometrisi, benzer bir şekilde kullanılabilir, ancak fluorometri avantajı, yüksek verim, numune en az bir manipülasyon ve hücre başına floresan yoğunluğu hızlı ölçümü ile değerlendirme olarak hızlı bir yöntemdir edilebilir. Benzer stratejiler, esasen yapışkan hücreler, canlı etiketli bakteriler, aktin polimerizasyonu, ve floresan kullanılarak herhangi bir işlem uygulanabilir. Bu nedenle, fluorometri düşük maliyetli, yüksek throughp için umut verici bir yöntemdirhücresel süreçlerin çalışmada ut yetenekleri.
Introduction
Floresan sinyal miktarının belirlenmesi yaygın, akım sitometri konfokal mikroskopi ve ELISA multiplex için analiz FRET, PCR kadar bilimsel yöntemlerle çok sayıda kullanılmıştır. Floresan görüntüleme ve miktar geniş bir uygulama vardır ve çeşitli hücresel süreçlerin kantitatif analiz için harika bir araç olabilir. Floresan belirteçleri ve sinyal kullanımı son on yılda devrim olmuştur, ve floresan plaka okuyucu çıkması hücresel süreçleri sırasında yayılan floresan yüksek verim miktarının kolaylaştırmıştır.
Florimetrik analiz fagositoz miktarının büyük bir araç olarak hizmet verebilir. Fagositoz, 1800 1 Metchnikoff tarafından fagositoz keşfinden bu yana çalışılmıştır. Yıllar geçtikçe, çeşitli yöntemler bakteriyel, viral, fungal ve parazitik patojenler 2-5 istila karşı doğal bağışıklık savunma için gerekli bu önemli süreci incelemek için kullanılmıştır. Sırayla miktar kullanılan mikroskopi ve Stereolojik tekniklerin Önceki yöntemler daha sonra içselleştirilmiş parçacıklar (manuel veya yazılım kullanımı ile) 6-8 sayılarak ölçüldü phagocytosing hücreleri, görselleştirmek için. Kantitatif analiz için yalnız mikroskopi kullanılarak bazı dezavantajları bakterilerin manuel sayım emek yoğun ve gözlemci önyargı daha eğilimli olduğunu vardır. Fagositoz belirlenmesinde kullanılan diğer bir yöntem, bakteriyel kültür tabakalarına (fagositoz sonra) hücre lizatları bakterilerin kaplama mikrobiyolojik bir tekniktir, ancak bu yöntem bakteri mekanizmaları ve kısmen içsel bakterilerin varlığı hesaba başarısız olabilir. Bu yöntem mikroskopi göre daha emek yoğun ve analiz için birkaç gün sürer. Akış sitometri fagositoz ölçmek için hızlı, en etkili yolu olarak görünmektedir ve birçok grup 9-11 tarafından kullanılmıştır, ancak yüksek maliyet yaygın in ile ilgiliDaha önce de belirtildiği deneylere göre analiz için gerekli gösterge en pahalı bir yöntem sağlar.
flüorometrik yöntem engelleyici maliyeti olarak değil floresan kullanarak ekipman tarafsız ölçümü sunar beri parçacık içselleştirilmesi analizi için flow sitometri için iyi bir alternatiftir. Fluorometri diğer katma faydaları, yüksek verimlilik ve etiketli içselleştirilmiş parçacıklar tarafından yayılan floresan ölçülmesi için yüksek verimlilik yetenekleri vardır.
Fluorometri Faydaları fagositoz dışındaki süreçlerin ölçümü için çıkarım olabilir. Örneğin, florometrik analiz aktin polimerizasyonunda hücre içi ya da zar bağlı reseptör, hücre geçirgenliği / canlılığı, transfeksiyon etkinliği değişiklikler ve modülasyon ifadesi değişikliklere yol açan herhangi bir işlem çalışma uygulanabilir. Florometrik tekniğin bir dezavantajı kullanılan etiketlerin bağlı olarak, yüksek olabilir, yaniDeney genellikle kat değişikliği veya kontrolden oranında artış göreli miktar üzerinden veri, göstererek çözülebilir değişkenliği deneme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Florometrik tekniğin başlıca kısıtlamaları deney varyans yanı sıra geniş bir yıkama ve yapışkan olmayan hücrelerin kullanımı ile ortaya çıkan hücre kaybı vardır.
Varyans nedeniyle hazır çözeltinin hazırlanması sırasında tartım ve pipetleme gibi floresan parçacıkların varyasyon büyük ölçüde görülmektedir deney için deney parçacıkların aynı sayıda muhafaza tam bir yol değildir. (-; Parçacıklar hemen eklenen ve kaldırılan t = 0 kontrol) deneyler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the following funding sources: RO1 DA 12104, RO1 DA 022935, RO1 DA031202, K05DA033881, P50 DA 011806, 1R01DA034582 (to S.R) and F31 DA026264-01A1, T32 DA07097 (to J.N.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1-μm yellow-green fluorescent Fluo-Spheres; | Molecular Probes | F8852 | combine 50μl with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Heat killed E. coli BioParticles fluorescein conjugate | Molecular Probes | E2861 | reconstitute (5 mg) in 50μl of PBS and combine with 50μl opsonizing reagent for 30 min at 37oC before use |
| Opsonizing reagent | Molecular Probes | E2870 | |
| Rhodamine phalloidin | Molecular Probes | R415 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| the items below are available in many brands but the items we used in this study are from the following manufacturers | |||
| RPMI Cell growth media | Gibco | Supplemented with 10% FBS and 1% pennicillin/Streptomycin; warm in 37oC before use | |
| Fluorescent plate reader-Fluostar Omega | BMG Labtech | ||
| Paraformaldehyde (16%) | Fischer Scientific | AA433689M | dilute to 4% before use |
| 96 well plates | Greiner | 655097 | clear or black or clear bottom – black plates |
| Multichannel pipette (8-12 channels) | |||
| Reagent reservoirs | |||
| 1x PBS | |||
| Microfuge tubes (0.6 ml) | |||
| Conicles (10 ml) | |||
References
- Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. , (2012).
- Burke, D. W., O’Connor, D. O., Zalenski, E. B., Jasty, M., Harris, W. H. Micromotion of cemented and uncemented femoral components. The Journal Of Bone And Joint Surgery. British Volume. 73 (1), 33-37 (1991).
- Duan, X., et al. Resistance to malaria by enhanced phagocytosis of erythrocytes in LMP7-deficient mice. PloS One. 8 (3), 59633 (2013).
- Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PloS One. 7 (3), 32621 (2012).
- Al-Bader, N., et al. Role of trehalose biosynthesis in Aspergillus fumigatus development, stress response, and virulence. Infection And Immunity. 78 (7), 3007-3018 (2010).
- Acosta-Iborra, B., et al. Macrophage oxygen sensing modulates antigen presentation and phagocytic functions involving IFN-gamma production through the HIF-1 alpha transcription factor. Journal Of Immunology. 182 (5), 3155-3164 (2009).
- Ojielo, C. I., et al. Defective phagocytosis and clearance of Pseudomonas aeruginosa in the lung following bone marrow transplantation. Journal Of Immunology. 171 (8), 4416-4424 (2003).
- Neu, C., et al. CD14-dependent monocyte isolation enhances phagocytosis of listeria monocytogenes by proinflammatory, GM-CSF-derived macrophages. PloS One. 8 (6), 66898 (2013).
- Sokolovska, A., et al. Activation of caspase-1 by the NLRP3 inflammasome regulates the NADPH oxidase NOX2 to control phagosome function. Nature Immunology. 14 (6), 543-553 (2013).
- Janko, C., et al. CRP/anti-CRP antibodies assembly on the surfaces of cell remnants switches their phagocytic clearance toward inflammation. Frontiers in Immunology. 2 (2), 70 (2011).
- Clatworthy, M. R., et al. Systemic lupus erythematosus-associated defects in the inhibitory receptor FcgammaRIIb reduce susceptibility to malaria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (17), 7169-7174 (2007).
- Ninkovic, J., Roy, S. Morphine decreases bacterial phagocytosis by inhibiting actin polymerization through cAMP-, Rac-1-, and p38 MAPK-dependent mechanisms. The American Journal Of Pathology. 180 (3), 1068-1079 (2012).
- Nix, R. N., Altschuler, S. E., Henson, P. M., Detweiler, C. S. Hemophagocytic macrophages harbor Salmonella enterica during persistent infection. PLoS Pathogens. 3 (12), 193 (2007).
- Xue, X., et al. Stable gene transfer and expression in cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells by a hyperactive Sleeping Beauty transposon system. Blood. 114 (7), 1319-1330 (2009).
- Hed, J. Methods for distinguishing ingested from adhering particles. Methods in Enzymology. 132. , 198-204 (1986).
- Scott, A. J., Woods, J. P. Monitoring internalization of Histoplasma capsulatum by mammalian cell lines using a fluorometric microplate assay. Medical Mycology. 38 (1), 15-22 (2000).
