Обнаружение гликогена в мононуклеарных клеток периферической крови с йодной кислотой Шиффа окрашивания
Summary
Periodic acid Schiff staining is a technique that visualizes the polysaccharide content of tissues. This article demonstrates periodic acid Schiff staining protocol adapted for use on peripheral blood mononuclear cells purified from human venous blood. Such samples are enriched for lymphocytes and other white blood cells of the immune system.
Abstract
Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. Polysaccharides such as glycogen, glycoproteins, and glycolipids stain bright magenta making it easy to enumerate positive and negative cells within the tissue. In muscle cells PAS staining is used to determine the glycogen content in different types of muscle cells, while in blood cell samples PAS staining has been explored as a diagnostic tool for a variety of conditions. Blood contains a proportion of white blood cells that belong to the immune system. The notion that cells of the immune system possess glycogen and use it as an energy source has not been widely explored. Here, we describe an adapted version of the PAS staining protocol that can be applied on peripheral blood mononuclear immune cells from human venous blood. Small cells with PAS-positive granules and larger cells with diffuse PAS staining were observed. Treatment of samples with amylase abrogates these patterns confirming the specificity of the stain. An alternate technique based on enzymatic digestion confirmed the presence and amount of glycogen in the samples. This protocol is useful for hematologists or immunologists studying polysaccharide content in blood-derived lymphocytes.
Introduction
Шиффа (PAS) окрашивание периодического кислота иммуногистохимическое метод, который широко используется в исследованиях мышц и диагностики. Он также используется в качестве диагностического инструмента на образцах крови. Методика работы с применением раствор периодной кислоты в образце, который окисляет единиц в создании полисахаридных альдегидных групп, которые вступают в реакцию с реагентом бесцветным Шиффа в результате чего получают глубокий пурпурный продукт. Этапы этой процедуры показаны на рисунке 1. Пятно превращается ничего с полисахаридами пурпурного, в том числе гликогена, гликопротеинов, гликолипидов, муцинов или других молекул с полисахаридных фрагментов.
ПАС окрашивание часто используется для определения уровня гликогена в мышечных волокнах. Разделы Мышцы ткани идеально подходят для техники, поскольку они прочно прикрепить к слайду и выдержать многочисленные стирки и окрашивания шаги. Гликоген является самым присутствуют в быстро сокращающиеся Тип II мышечные волокна, которые имеют высокий спросдля быстрого производства АТФ, требующей гликогена для максимального 1,2 производительности. Гликоген представляет собой разветвленный полимер глюкозы, который может быть разбит на свободной глюкозы под действием ферментов гликогенфосфорилазы. Во время отдыха и питательной-достаточности, гликоген пополняется в процессе гликогенеза, в то время как во время питательной недостаточности или высоких энергий спроса; гликоген распадается на глюкозу гликогенолиза. Уже с изучили 1950-х годов клиницисты ученые PAS окрашивания образцов крови для анализа содержания гликогена в различных заболеваний 3-7. Например, в Помпа болезней-добросовестного гликогена болезням лейкоциты накапливать большие количества гликогена, что существенно отличается от здоровых 8.
Это видео-статья демонстрирует адаптированную версию окрашивания PAS для использования на мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) образцов из венозной крови здоровых людей. PBMCs в основном содержат лимфоцитов Т-лимфоцит и семей лимфоцитов B, а также других иммунных клеток, таких как естественных клеток-киллеров и моноцитов. Первый этап очистки удаляет эритроциты, нейтрофилы, гранулоциты и другие. Этот метод позволяет получать данные о концентрированной доли лимфоцитов, позволяющих более надежной подсчета PAS-положительных клеток в сравнении с использованием целых мазки крови.
Рисунок 1:. Шаг за шагом методологии PAS окрашивания на РВМС () Во-первых, изоляция РВМС достигается за счет фиколл градиента, левая панель показывает подготовку перед центрифугированием, правая панель показывает его после центрифугирования, где Баффи пальто, содержащий РВМС наблюдается в центре трубки. (B), выделенные РВМС закреплены на слайде с помощью формалина-этанол фиксирующие Солуния. Ползун осторожно промывают дистиллированной водой из пластиковой бутылки для стирки. (С) слайд помещают в 100 мл химический стакан на полпути, заполненной раствором амилазы, которые будут растворяться гликогена. Ползун осторожно промывали. (D) скольжения обрабатывают раствором йодной кислотой, где окисление происходит сахаридов. Слайды мягко промыть; это будет удалить избыток периодический кислоту и остановить стадию окисления. (е) если реагент Шиффа добавляют к слайдам, он будет реагировать с альдегидами, созданных в ходе стадии окисления. Это бесцветное реагента будет приводить к темно-красного пурпурного продукта. Слайды осторожно промывают, чтобы удалить избыток реагента Шиффа.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги этого видео статьи были во время стирки и амилазы обработки клеток. При промывке слайды, ключевым шагом было с помощью пластиковой податливый стиральная бутылку и вода мягко запустить через образец на слайде и не стремимся непосредственно на образцах. Даже малейшее п?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by a grant from the NSERC Discovery program grant number RGPIN 418522-2013. We thank R. Kilgour for helpful discussions, and Katelin Gresty and Dr. A. Berghdal for providing the mouse muscle sections.
Materials
| Periodic Acid Shiff Kit | Sigma-Aldrich | 395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/395b?lang=en®ion=CA |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich | A3176 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a3176?lang=en®ion=CA |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich | MAK016 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/mak016?lang=en®ion=CA |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4779441 |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used |
Riferimenti
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin’s respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits). Biochimica. 11 (14), 2627-2633 (1972).
- Jones, R. V., Goffi, G. P., Hutt, M. S. R. Lymphocyte glycogen content in various disease. J. Clin. Pathol. 15 (1), 36-39 (1962).
- Scott, R. B. Glycogen in human peripheral blood leukocytes. I. characteristics of the synthesis and turnover of glycogen in vitro. J. Clin. Invest. 47 (2), 344-352 (1968).
- Fedele, D., et al. positive index of lymphocytes and metabolic control in insulin-treated and type II diabetes mellitus. Diabete Metab. 9 (3), 188-192 (1983).
- Brelińska-Peczalska, R., Mackiewicz, S. Cytochemical studies of peripheral blood granulocytes and lymphocytes in patients with systemic lupus erythematosus. Pol.Med.Sci.Hist.Bull. 15 (2), 231-234 (1976).
- Yunis, A. A., Arimura, G. K. Enzymes of glycogen metabolism in white blood cells. I. glycogen phosphorylase in normal and leukemic human leukocytes. Cancer, Res. 24, 489-492 (1964).
- Hagemans, M. L., et al. PAS-positive lymphocyte vacuoles can be used as diagnostic screening test for pompe disease. J. Inherit. Metab. Dis. 33 (2), 133-139 (2010).
- Totsuka, Y., et al. Physical performance and soleus muscle fiber composition in wild-derived and laboratory inbred mouse strains. 95 (2), 720-727 (2003).
- Murat, J. C., Serfaty, A. Simple enzymatic determination of polysaccharide (glycogen) content of animal tissues. Clin. Chem. 20 (12), 1576-1577 (1974).
- Arrizabalaga, O., Lacerda, H. M., Zubiaga, A. M., Zugaza, J. L. Rac1 protein regulates glycogen phosphorylase activation and controls interleukin (IL)-2-dependent T cell proliferation. J. Biol. Chem. 287 (15), 11878-11890 (2012).
- Pelletier, J., G, J., Mazure, N. M. Biochemical titration of glycogen in vitro. J.Vis.Exp. (81), (2013).
- Roach, P. J., Depaoli-Roach, A. A., Hurley, T. D. Tagliabracci V.S. Glycogen and its metabolism: Some new developments and old themes. Biochem.J. 441 (3), 763-787 (2012).
- Salmoral, E. M., Tolmasky, D. S., Krisman, C. R. Evidence for the presence of glycogen in rat thymus. Cell Mol.Biol. 36 (2), 163-174 (1990).
- Darlington, P. J., et al. Diminished Th17 (not Th1) responses underlie multiple sclerosis disease abrogation after hematopoietic stem cell transplantation. Ann.Neurol. 73 (3), 341-354 (2013).
