La colorazione periodica con acido di Schiff è una tecnica che visualizza il contenuto di polisaccaridi dei tessuti. Questo articolo dimostra il protocollo periodico di colorazione acida di Schiff adattato per l'uso su cellule mononucleate del sangue periferico purificate da sangue venoso umano. Tali campioni sono arricchiti per i linfociti e altri globuli bianchi del sistema immunitario.
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Articolo metodologico
Rilevamento glicogeno in cellule periferiche mononucleate del sangue con Periodic Acid Schiff colorazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
La colorazione periodica con acido di Schiff (PAS) è una tecnica immunoistochimica utilizzata nelle biopsie muscolari e come strumento diagnostico per campioni di sangue. I polisaccaridi come glicogeno, glicoproteine e glicolipidi colorano il magenta brillante, facilitando l'enumerazione delle cellule positive e negative all'interno del tessuto. Nelle cellule muscolari la colorazione PAS viene utilizzata per determinare il contenuto di glicogeno in diversi tipi di cellule muscolari, mentre nei campioni di cellule del sangue la colorazione PAS è stata esplorata come strumento diagnostico per una varietà di condizioni. Il sangue contiene una percentuale di globuli bianchi che appartengono al sistema immunitario. L'idea che le cellule del sistema immunitario possiedano glicogeno e lo utilizzino come fonte di energia non è stata ampiamente esplorata. Qui, descriviamo una versione adattata del protocollo di colorazione PAS che può essere applicato su cellule immunitarie mononucleate del sangue periferico da sangue venoso umano. Sono state osservate cellule piccole con granuli PAS-positivi e cellule più grandi con colorazione PAS diffusa. Il trattamento dei campioni con amilasi abroga questi modelli, confermando la specificità della colorazione. Una tecnica alternativa basata sulla digestione enzimatica ha confermato la presenza e la quantità di glicogeno nei campioni. Questo protocollo è utile per ematologi o immunologi che studiano il contenuto di polisaccaridi nei linfociti derivati dal sangue.
Introduzione
Acido periodico Schiff (PAS) è una tecnica di colorazione immunoistochimica che è ampiamente utilizzato nella ricerca e diagnostica muscolare. Viene anche utilizzato come strumento diagnostico su campioni di sangue. La tecnica funziona applicando soluzione di acido periodico al campione, che ossida unità all'interno dei polisaccaridi creazione di gruppi aldeidici che reagiscono con il reagente di Schiff incolore producendo così un prodotto magenta profondo. I passi di questa procedura sono mostrati in Figura 1. La macchia gira nulla con polisaccaridi magenta, tra glicogeno, glicoproteine, glicolipidi, mucine, o altre molecole con porzioni polisaccari....
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Protocollo
La ricerca con campioni di sangue umano è stato approvato dalla Concordia University Ethics Review Board, numero del certificato 10000618. Il lavoro sul muscolo del mouse è stato approvato dalla Concordia University Ethics Review Board, numero del certificato 2010BERG.
1. PBMC Isolamento da sangue intero
NOTA: Effettuare questa procedura in un armadio biosicurezza con tecnica sterile e attrezzature produttore-sterilizzati.
- Versare con cautela 10-15 ml di sangue intero dai eparinizzato tubi (anticoagulante) di raccolta del sangue in una provetta sterile da 50 ml. Per fuoriuscite di sangue minori, pul....
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Risultati
Per convalidare i reagenti e la tecnica di base, colorazione PAS è stata eseguita secondo le istruzioni del produttore su sezioni muscolari del mouse soleo. La colorazione è stato fatto stesso giorno del sacrificio e nell'ultimo passaggio della colorazione, le sezioni sono state fissate dal xilene. Il muscolo soleo è nota la presenza di ~ 35% di glicogeno-positivo cellule 9. Le cellule muscolari colorate visualizzate due distinte granuli puntiformi Caratteristiche-PAS-positiva all'interno della cellula, e una.......
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Discussione
Le fasi critiche di questo articolo video erano durante il lavaggio e amilasi trattamento delle cellule. Mentre si lava le diapositive, il passo fondamentale stava usando una bottiglia di plastica di lavaggio squeezable e lasciando scorrere l'acqua dolcemente attraverso il campione sul vetrino e non puntando direttamente sui campioni. Anche la minima pressione dell'acqua diretta potrebbe causare le cellule a venire fuori la diapositiva. Un altro passo fondamentale è stato quello di utilizzare lo stesso scivolo p.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del programma NSERC Discovery numero RGPIN 418522-2013. Ringraziamo R. Kilgour per le utili discussioni, e Katelin Gresty e il Dr. A. Berghdal per aver fornito le sezioni muscolari del topo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit Periodic Acid Shiff |  Sigma-Aldrich | 395B | Portare a temperatura ambiente prima dell'uso. I materiali contenuti nel kit sono tossici e nocivi. Usare cautela. |
| α-Amilasi dal pancreas di suino | Sigma-Aldrich | A3176 | |
| Microscopio Binoculare | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Kit per Saggio del Glicogeno | Sigma-Aldrich | MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare | 17-1440-02 | Polimero sintetico non ionico di saccarosio. |
| Centrifuga | Per l'isolamento dei PBMC, sono stati utilizzati rotorini a cestello oscillante. |
Riferimenti
- Rich, P. R. The molecular machinery of keilin's respiratory chain. Biochem. Soc. Trans. 31 (Pt 6), 1095-1105 (2003).
- Peter, J. B., Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Gillespie, C. A., Stempel, K. E. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea p....
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Ristampe e permessi
