Protokoll for å studere Extinction av aircondition Fear i Naturally Sykling hunnrotter

Summary

Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.

Abstract

Utryddelse av betinget frykt har blitt grundig studert i mannlige gnagere. Nylig har det vært et økende antall studier som indikerer at nevrale mekanismer for visse atferds oppgaver og svar atferd er annerledes hos kvinner og menn. Ved hjelp av kvinner i forskningsstudier kan representere en utfordring på grunn av variasjonen av gonadale hormoner under brunst. Denne protokollen beskriver veletablerte prosedyrer som er nyttige i å undersøke rollen som østrogen i frykt utryddelse minne konsolidering i hunnrotter. Fase av brunst og eksogene østrogen administrasjon før utryddelse trening kan påvirke utryddelse tilbakekalling 24 timer senere. Vaginal swabbing teknikk for estrous fase identifikasjon beskrevet her hjelpemidler til eksamen og manipulering av naturlig sykling gonadale hormoner. Bruken av denne grunnleggende gnager modellen kan ytterligere avgrense mekanismer som østrogen kan modulere frykt utryddelse minne ihunner.

Introduction

Iboende kjønnsforskjeller er observert på tvers av ulike kognitive atferd og lærings paradigmer i både mennesker og gnagere. For eksempel har det vært rapportert at kvinner generelt har sterkere verbale og detalj-orientert evner, mens menn har bedre romlige evner ^1-3. Disse kjønnsforskjellene kan skyldes delvis til påvirkning av gonadale hormoner. Høye østradiolnivåer forbedre ytelsen på oppgaver der kvinner er bedre, men forverres ytelse på oppgaver som menn vanligvis gjør det bra ^4-6. Selv om dette beviset er overbevisende, den begrensede evne til å fullstendig kontrollere eksperimentelle miljøer i studier på mennesker gjør det vanskelig å avgjøre om disse effektene på atferd kan tilskrives spesifikt til hormoner. Dyreforsøk, i motsetning, tillate fullstendig kontrollerte forhold.

Selv om de grunnleggende nevrale mekanismer for utryddelse frykt har blitt identifisert og er godt studert hos menn, er det uklart omDisse systemene er de samme i kvinner eller hvordan de endres over brunst. Frykt condition og utryddelse er mye brukt atferds paradigmer i gnagere og mennesker for å gjennomføre studier knyttet til angstlidelser. Gitt at kvinner har en høyere risiko for angstlidelser samt høyere symptom varighet og alvorlighetsgrad ^7-13, er det avgjørende å inkludere kvinner i disse studiene. Underrepresentasjonen av kvinner i denne forskningen kan tilskrives utfordringene i estrous fase overvåking og regnskap for de atferdsmessige effekter av kjønnshormoner. Laboratorier som gjør undersøke kvinner i denne forbindelse møte problemer som ofte ikke blir rapportert eller ikke er beskrevet i metodene for sine studier.

Emerging bevis i gnagere tyder på at kjønnsforskjeller i utryddelse frykt er modulert av gonadale hormoner ^14-18. I frykt conditioning, blir dyrene opplært til å frykte en bestemt stimulus. Etter en rekke uarmerte presentasjoner avstimulans, dyrene lære ikke å frykte køen, en prosess som kalles utryddelse. Hvor godt dyret lærer og konsoliderer minnet om å lære denne oppgaven kan observeres under en utryddelse tilbakekalling test gitt noen tid etter utryddelse trening. Mindre frykt uttrykk under utryddelse tilbakekalling demonstrerer god utryddelse minne konsolidering. Nye funn fra vårt laboratorium tyder på at østrogen kan modulere konsolideringen av frykt utryddelse hukommelse og forbedre utryddelse tilbakekalling. Spesifikt hunnrotter som er slukket i proestrus, fasen til brunst under hvilken sirkulerende østrogennivåer topp, viser forbedret retensjon av utryddelse minne. I kontrast, kvinner som er slukket i lav-østrogen metestrus fase skjerm relativt dårlig utryddelse tilbakekalling, noe som kan forbedres med eksogen østradiol administrasjon før eller umiddelbart etter utryddelse trening ^15,16. Nevrale mekanismer for utryddelse minne konsolidering (inkluding rolle gonadale hormoner) hos kvinner er ikke klar.

I forsøksdyr, kan rollen av hormoner bli undersøkt ved hjelp av invasive kirurgiske fjerning prosedyrer som kastrering og ovariektomi. I etterkant utvinning fra kirurgi, gonadale hormoner ofte eksogent manipulert under utførelsen av en atferds oppgave ^19. Denne tilnærmingen har gitt viktig informasjon om kjønnshormoner og er nyttig fordi det gir mulighet for godt kontrollerte manipulasjoner av gonadale hormoner (i form av timing og dose) ^20-23. Denne tilnærmingen er imidlertid ikke vurdere innvirkningen av de naturlig forekommende svingninger som opptrer på tvers av brunst heller ikke representerer de "normale" dyr, for derved å begrense den translasjonelle potensial til humane studier. Det har blitt godt dokumentert at kvinnelige kjønnshormonet nivåer topp og nedgang på bestemte faser av brunst, og østrogen reseptor uttrykk endringer i syklusen,og etter ovariektomi ^24. Dermed er det behov for å gjennomføre studier på kvinner med intakte gonader og avgrense eksperimentelle design for pålitelig å studere effekter som høye og lave østrogen stater kan ha på kvinner i hele livsløpet.

Denne protokollen fokuserer på effekten av østrogen på de nevrobiologiske systemer som er involvert i utryddelse frykt. Den beskriver hvordan du: 1) nøye overvåke brunst, 2) utarbeide effektive doser av østradiol for systemisk administrasjon, og 3) følger en atferds paradigme som omfatter frykt condition, utryddelse, og hente inn naturlig sykling hunnrotter. Denne protokollen kan endres med andre farmakologiske manipulasjoner og cellulære og molekylære verktøy for å hjelpe studier for å bedre forstå kjønnsforskjeller som er observert i kondisjonert frykter utryddelse oppførsel. Merk at prosedyrene som er beskrevet nedenfor er de som brukes innenfor vårt laboratorium, og det finnes en rekke varianter av disse prosedyrene in litteraturen.

Protocol

MERK: Alle prosedyrer i denne protokollen er godkjent av Subcommittee på Forsknings Animal Care, som fungerer som Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) for Massachusetts General Hospital, og er i samsvar med National Institutes of Health retningslinjer. 1. Animal Bolig og håndteringsprosedyre Ved ankomst huset voksen Sprague Dawley hunnrotter ca 8-10 ukers alder (som veier 200-225 g) i grupper på 3-4 tommer plastbøtter med trespon sengetøy. Holde dem på en diet…

Representative Results

I denne utryddelse frykt tilbakekalling protokollen, ble prosent frysing målt som en indikator på frykt. Dyr som slukkes godt og beholdt minnet om utryddelse trening utstilt lav frykt på den siste dagen av atferds testing i løpet av utryddelse tilbakekalling. Hann- og hunnrotter ikke vesentlig forskjellig i kondisjonert frykt uttrykk under condition, utryddelse, og husker faser (figur 2). Men blir en kjønnsforskjellen tydelig når dyrene blir analysert separat som høye og lave østrogen estrous fa…

Discussion

Utryddelse frykten har blitt studert hos hannrotter med nevrale mekanismer som medierer betinget frykt utryddelse identifiseres og vurderes under forskjellige manipulasjoner. Relativt få studier har undersøkt hunnrotter eller rollen gonadale hormoner i utryddelse frykt. Spesifikt studere effekten av østrogen på utryddelse frykt, er naturlig sykling hunnrotter utsatt for en tre-dagers atferds paradigme. Denne prosedyren består av tilvenning / condition, utryddelse, og utryddelse tilbakekalling faser. Ved hjelp av de…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Graphic State	Coulbourn Instruments
Sound-attenuating box	Med Associates, Inc.	NIR-022MD
Estradiol	Sigma-Aldrich	E1024	In sesame oil for subcutaneous injection
Sesame oil	Sigma-Aldrich	S3547-250ML
Freezescan	Cleversys, Inc.
Dip quick stain	Jorgensen Laboratories, Inc.	J0322A1, J0322A2, J0322A3
Cotton-tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-114	6-inch, sterile
0.9% saline	LabChem, Inc.	LC23460-2	Sodium chloride w/v
Selectfrost microscope slides	Fisher Scientific	12-550-003
Virex II 256	Diversey, Inc.	5019317	Dilute 1:256 with water
Luer-Lok Tip 1ml Syringes	Becton Dickinson	309628
Hypodermic disposable needles	Exelint International, Co.	26402	26-gauge