Per affrontare i meccanismi di demielinizzazione e apoptosi neuronale nelle lesioni corticali dei disturbi demielinizzanti infiammatori, vengono utilizzati diversi modelli animali. Qui descriviamo un approccio ex vivo utilizzando cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti su fette di cervello, con conseguente morte oligodendrogliale e neuronale. Vengono discusse le potenziali applicazioni e i limiti del modello.
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Articolo metodologico
Un Ex vivo Modello di un attacco T-Cell Oligodendrocyte-diretto nel acute cervello fette
In questo articolo
Sommario
Abstract
La morte degli oligodendrociti accompagnata dalla distruzione di neuroni e assoni sono reperti istopatologici tipici nelle lesioni della sostanza grigia corticale e sottocorticale nei disturbi infiammatori demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM). In questi disturbi, si trovano principalmente cellule T CD8+ di putata specificità per antigeni correlati alla mielina e agli oligodendrociti, per cui l'apoptosi neuronale nelle lesioni della sostanza grigia può essere un effetto collaterale di queste cellule. Vengono stabiliti diversi tipi di modelli animali per studiare i meccanismi alla base dei processi fisiopatologici menzionati. Tuttavia, sebbene imitino alcuni aspetti della SM, è impossibile sezionare l'esatto meccanismo e il decorso temporale della morte delle cellule neuronali "collaterali". Per affrontare questo corso, qui mostriamo un protocollo per studiare i meccanismi e la risposta temporale del danno neuronale a seguito di un attacco di cellule T CD8+ diretto da oligodendrociti. Per colpire solo la guaina mielinica e gli oligodendrociti, le cellule T CD8+ specifiche per gli oligodendrociti attivate in vitro vengono trasferite in fette cerebrali isolate acutamente. Dopo un periodo di incubazione definito, il danno mielinico e neuronale può essere analizzato in diverse regioni di interesse. Verranno discusse le potenziali applicazioni e i limiti di questo modello.
Introduzione
La morte degli oligodendrociti e la distruzione della guaina mielinica accompagnata dalla perdita di neuroni e assoni sono reperti patologici tipici nelle lesioni della sostanza grigia in individui affetti da sclerosi multipla (SM)1,2. Le lesioni corticali possono essere suddivise finora in tre diversi sottotipi2: lesioni subpiali, intracorticali e leucocorticali. Rispetto alle placche di sostanza bianca, gli infiltrati sono caratterizzati da una predominanza di cellule T CD8+, suggerendo un loro possibile ruolo decisivo nell'infiammazione della sostanza grigia3. Inoltre, espansioni oligoclonali nel sangue, nel liquido cereb....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che utilizzano topi devono essere effettuate in conformità con le linee guida del rispettivo cura degli animali e l'uso del comitato istituzionale.
1. Osservazioni generali per esperimenti del mouse
- Tenere i topi in condizioni esenti da organismi patogeni e consentire loro l'accesso a cibo e acqua ad libitum.
NOTA: E 'importante usare i topi per età e sesso nei gruppi trattati perché i modelli immunologiche possono variare a seconda dell'età e del sesso.
2. Preparazione e attivazione di OVA-specifiche cellule T CD8 + (OT-I)
- Ese....
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Risultati
Dopo incubazione di fette di cervello con CD8 + T-cellule oligodendrociti-diretta, oligodendrociti nonché neuroni apoptosi (Figure 2A e 1C, rispettivamente). Segni istologici di apoptosi (ad esempio, caspasi-3, Tunel) possono essere rilevati prima dopo 3 ore di incubazione. Il periodo di incubazione non deve essere superiore a 8 ore per garantire una buona qualità della preparazione e risultati riproducibili. Le cellule apoptotiche possono essere trovati in tutto il fetta con prepond.......
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Discussione
Diversi modelli animali sono stati descritti nel corso degli ultimi decenni, per affrontare le caratteristiche patologiche di disturbi demielinizzanti infiammatorie come MS. In vivo modelli di topo e ratto sono ampiamente utilizzati per simulare le caratteristiche fisiopatologiche della malattia, vale a dire, l'analisi delle conseguenze dei processi di demielinizzazione e rimielinizzazione e di episodi Interlacciati di infiammazione e neurodegenerazione. Tuttavia, solo un approccio ex vivo consente.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) Münster (SEED 03/12, SB), Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB TR128, TP B6 to S.G.M. ME3283/2-1 to S.G.M.) e da Innovative Medizinische Forschung, Münster (I-BI111316, SB e SGM).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra a 12 pozzetti | Corning | 3513 | |
| 2-Mercaptoetanolo | Gibco | 31350-010 | |
| 2-Metilbutano | Roth | 3927.1 | |
| 70 &; m filtro | Falcon | 352350 | |
| CaCl2 | Merck | 1.02382.0500 | cloruro di calcio |
| CD8+-kit di isolamento | Miltenyi Biotech | 130-090-859 | |
| D(+)-glucosio | Merck | 1.08337.1000 | |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| FCS | PAA Laboratories | A15-151 | siero fetale per vitelli |
| Gentamicina | Gibco | 15750-060 | |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-050 | |
| IL-2 | Peprotech | 212-12 | |
| Isofluran | Abbott | 05260-05 | |
| KCl | Merck | 1.04933.0500 | cloruro di potassio |
| KHCO3 | Sigma | P9144 | carbonato acido di potassio |
| L-glutammina | Gibco | 35050-038 | |
| MgSO4 | Merck | 1.05886.0500 | solfato di magnesio |
| NaCl | Sigma | 31434 | cloruro di |
| sodioNaH2PO4 * H2O | Merck | 1.06346.0500 | sodio idrogeno fosfato |
| NaHCO3 | Merck | 1.06329.0500 | sodio carbonato acido |
| NaOH | Merck | 1.09137.1000 | sodio idrossido |
| NH4Cl | Sigma | 213330 | cloruro di ammonio |
| Aminoacido non essenziale | Gibco | 11140-050 | |
| OVA (257-264) | Genscript | RP10611 | ovoalbumina |
| TUBI | Sigma | P6757 | |
| Saccarosio | Merck | 1.07687.1000 | |
| Tissue-Tek OCT | Sakura | 4583 |
Riferimenti
- Moll, N. M., et al. Cortical demyelination in PML and MS: Similarities and differences. Neurology. 70 (5), 336-343 (2008).
- Peterson, J. W., Bo, L., Mork, S., Chang, A., Trapp, B. D. Transected neurites, apoptotic neurons, and reduced infl....
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Ristampe e permessi
