Isolierung von Myofibroblasten aus Maus und Mensch Ösophagus
Summary
We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express α-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.
Abstract
Murine und menschliche Speiseröhre Myofibroblasten werden über enzymatische Verdauung erzeugt. Neugeborene (8-12 Tage alt) murine Speiseröhre wird geerntet, zerkleinert, gewaschen und bis zur enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 25 min unterzogen. Menschliche Speiseröhre Resektionsproben aus Muscularis propria und Adventitia befreit und der verbleibende Schleimhaut zerkleinert und einem enzymatischen Verdau mit Kollagenase und Dispase für 6 h unterzogen. Kultivierte Zellen exprimieren α-SMA und Vimentin und Desmin ausdrückliche schwach oder gar nicht. Die Kulturbedingungen sind nicht förderlich für das Wachstum von Epithelzellen, hämatopoietische oder Endothelzellen. Kultur Reinheit wird durch durchflusszytometrische Beurteilung der Zelloberflächenmarker Expression potentieller Gefährdungs hämatopoetischen und Endothelzellen bestätigt. Das beschriebene Verfahren ist einfach und führt zu einer konsistenten Erzeugung nicht hematopoieitc nicht endothelial Stromazellen. Einschränkungen dieser Technik sind inhärent auf die Verwendung vonPrimärkulturen in der Molekularbiologie Studien, dh die unvermeidlichen Schwankungen zwischen den Kulturen in den verschiedenen Mäusen oder Menschen fest gestoßen. Primäre Kulturen sind jedoch ein repräsentativer Reflexion des in vivo-Zustand im Vergleich zu Zelllinien. Diese Verfahren stellen auch Forscher die Fähigkeit zur Isolierung und Kultur Stromazellen aus verschiedenen klinischen und experimentellen Bedingungen, so dass Vergleiche zwischen den Gruppen. Dadurch gekennzeichnet Speiseröhren Stromazellen können auch in funktionalen Studien, die epithelial-stromale Wechselwirkungen in Erkrankungen der Speiseröhre verwendet werden.
Introduction
Epithelial-stromale Wechselwirkungen an der Regulation einer Vielzahl von Gastrointestinaltrakt Funktionen einschließlich Schleimhautregeneration, Reparatur, Fibrose und Karzinogenese 1,2 beteiligt. Diese Wechselwirkungen sind am besten in den Dünndarm und Dickdarm untersucht und kann in ähnlicher Weise eine Rolle bei der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen 3. Eine Subpopulation von Darm und Kolon Stromazellen bezeichnet Myofibroblasten wurde gezeigt, dass bei der Vermittlung der Gewebeschädigung, Entzündung teil und Reparatur 4,5. Im distalen Gastrointestinaltrakt werden diese spindelförmige Zellen angrenzend an die Basalmembran an der Grenzfläche zwischen Epithel und Lamina propria und werden als α-SMA und Vimentin positiv definiert, pan-Cytokeratin negativ und schwach positive oder Desmin negativ 5.
Die Speiseröhre Stroma wurde nicht konsequent auf zellulärer oder molekularer Ebene charakterisiert. Unsere Arbeit im murinen Speiseröhre demonstrated α-SMA und Vimentin-Zellen in der Speiseröhre Stroma, gelegentlich darunter liegenden zu dem Plattenepithel 6. Epithelial-Stroma-Wechselwirkungen in der Schleimhaut der Speiseröhre Erkrankungen wie Magen- und Speiseröhren vermittelten Verletzung 6 und eosinophile Ösophagitis 3 in Verbindung gebracht. Fibrotischen Strikturen auch eine bekannte Komplikation der Schädigung der Speiseröhre und Stromazellen in der Pathogenese von gastrointestinalen Fibrose in Verbindung gebracht. Isolation dieser Zellen wird dazu beitragen, zu tun, die notwendigen Studien zur gestörten Signalwege zu untersuchen.
Diese Vorlage enthält die erforderlichen Primärkulturen von α-SMA positiv, Vimentin positiven Myofibroblasten, dass bestehende Wissenslücken in Bezug auf Signalwege vermitteln, diese Interaktionen angesprochen werden kann etablieren Techniken. Die beschriebene Technik wurde erfolgreich von den Autoren verwendet wird, um primäre murine Colon Myofibroblasten 7 und furthe etablierenr für die Einrichtung von murinen 6 und Menschen Myofibroblasten-ähnlichen Speiseröhren Stromazellen angepasst.
Wir beschreiben hier Bedingungen benötigt, um festzustellen und zu charakterisieren diese Kulturen von Maus oder Mensch Ösophagus vor in Zukunft funktionelle Studien verwenden etabliert. Kulturen angebaut und für bis zu 15 Passagen genutzt werden. Isolation und Etablierung von Primärkulturen über die Methoden unten beschrieben erzeugt Stromazellen mit Myofibroblasten Phänotyp; α-SMA, Vimentin positiv und schwach positiv oder negativ für Desmin und Cytokeratin negativ. Dieser Phänotyp unterscheidet sich vom Phänotyp des Ösophagus Fibroblasten, die überwiegend Vimentin ist positiv, α-SMA negativen 3 oder der α-SMA positiv, Vimentin-negativen Phänotyp des Muscularis mucosae 6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Techniken zur Primärkultur Generation sind in der Regel ähnlich bei der Verwendung von murinen oder menschlichen Gewebes mit Hacken und Aufschlusszeiten für Gewebegröße angepasst. Unsere Erfahrungen mit murinen Gewebe schlägt vor, dass mit den oben beschriebenen Methoden konsequent in erfolgreiche Etablierung der Primärkulturen führen. Kritische Schritte innerhalb des Protokolls sind die Sterilisation von chirurgischen Geräten und folgenden Norm sterile Techniken der Gewebekultur. Das Alter der Mäuse ist a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Authors have nothing to disclose.
Materials
| Name | ||
| Tissue culture reagents | ||
| HBSS | Sigma Aldrich | H6648 |
| dispase | GIBCO, Invitrogen | 17105-041 |
| collagenase XI | Sigma-Aldrich | C9407 |
| DMEM | GIBCO, Invitrogen | 11965-092 |
| sorbitol | Sigma-Aldrich | S1876 |
| FBS | Sigma) | F42442 |
| transferrin | Roche | 10-652-202-001 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E9644 |
| trypsin/EDTA | Corning | 25-052-Cl |
| Reagents for immunostaining | ||
| goat serum | Sigma Aldrich | G9023 |
| Mouse mAB to α-SMA | abcam | ab7817 |
| Rabbit pAB to vimentin | abcam | ab45939 |
| Cy2 conjugated Goat anti Rabbit | Jackson ImmunoResearch | 111-225-144 |
| DAPI | sigma-aldrich | D8417 |
| CD31 conjugated to eFluor 450 | ebiosciences | 48-0319-410 |
| CD90 conjugated to APC | ebiosciences | 17-0909-41 |
| Annexin V and 7AAD | BD Pharmigen | 559763 |
| mouse Fc block for CD16/CD32 | BD Pharmigen | 2136662 |
| Equipment | ||
| 5 ml tube | eppendorf | 30108310 |
| Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope | Motic AE31 inverted microscope |
| Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators | Nuaire Biosafety Cabinet and Incubators |
| 4-well chamber slides | Thermo Scientific | 177437 |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf Centrifuge 5810R |
| Olympus Vacuum-Driven Filter System | Genesee Scientific | 25-227 |
| Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope | Nikon Eclipse TE300 Fluorescent Microscope (Tokyo, Japan) | |
| 6 well plates | Corning | 3516 |
| T25 Flasks | TRP | 90026 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Dissection Scissors | Dissection Scissors | Dissection Scissors |
| Dissection Forceps | Dissection Forceps | Dissection Forceps |
| Single Tipped Q-Tips | Kendall | 540500 |
| T75 Flasks | Corning | 43064 |
| Software | ||
| Metamorph software (Molecular Devices) | Molecular Devices | |
| FACSCAlibur | BD Bioscience | |
| FACSVerse | BD Bioscience |
Riferimenti
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