Proteômica Profiling de macrófagos por eletroforese 2D
Summary
Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
Abstract
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
Introduction
Os macrófagos são células heterogéneas e de plástico que são capazes de adquirir fenótipos funcionais distintos. In vivo, estas células respondem a uma grande variedade de micro signalssuch ambiental como produtos microbianos, citoquinas, etc. 1. In vitro, o fenótipo pró-inflamatória (M1) de macrófagos pode ser induzida por lipopolissacarídeo (LPS) e o fenótipo anti-inflamatória (M2) por algumas citocinas tais como a interleucina-4 (IL-4). Além disso, os macrófagos podem alternar de um M1 M2 activado para fenótipo, e, inversamente, mediante sinais específicos 2.
Dependendo do fenótipo, os macrófagos possuem diferentes funções. M1 macrófagos são células que produzem citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral α (TNF-α), para matar os microorganismos ou células tumorais 3. Em contraste, os macrófagos M2 evitar estes resposta inflamatória como na cicatrização de feridas e fibrose através da produção de anti-inflammatory factores, tais como TGF-β 3,4.
As células mononucleares do sangue periférico humano a partir de dadores saudáveis foram isoladas por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll como previamente descrito 5 utilizando uma técnica adaptada de Boyum 6. Os macrófagos em cultura podem ser diferenciadas em M1 ou M2 fenótipo após 6 dias de cultura primária 7.
Análise da expressão de proteínas ou mudanças de proteína entre os dois subtipos de macrófagos sob vários estímulos controlados, tais como patogenicidade hospedeiro ou toxinas microbianas, será útil para decifrar a funcionalidade do pro- macrófagos e anti-inflamatórios.
Proteômica são ferramentas exclusivas para o monitoramento direto de proteínas que são especificamente para cima ou para baixo-regulado em macrófagos cultivados humanos sob vários estímulos. Corantes fluorescentes resolveu algumas das limitações de eletroforese em gel 2D, como a baixa sensibilidade e análise de imagem de 8 < / Sup>. Os corantes que reagem com resíduos de cisteína aumentou a sensibilidade de detecção em comparação com aqueles reagir com 9 resíduos de lisina. Em um estudo anterior, demonstramos a utilidade de rotulagem saturação DIGE para a análise de amostras de escassos 10 em comparação com o 2D eletroforese manchada de prata clássica 11. Esta tecnologia é útil para analisar rapidamente modificações de proteína entre os dois subtipos de macrófagos ou entre os macrófagos não tratados e tratados do mesmo subtipo.
As vantagens desta técnica são proteómica ter acesso às informações do tamanho da proteína e modificações pós-tradução através da análise do gel 2D 12. Deve ser tomado em consideração que esta não é uma técnica de alto rendimento, o que limita o número de amostras que podem ser analisadas. O desenvolvimento de ensaios de alto rendimento com base em espectrometria de massa como revisto recentemente 13 pode melhorar esta.
_content "> Aqui apresentamos como realizar análise 2D DIGE da extração de proteínas de macrófagos em cultura através dos processos de eletroforese, isoelectrofocusing e SDS-PAGE, bem como informações sobre a utilidade do software 2D adequada.Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo aqui descrito detalha um método para analisar o impacto de vários estímulos dos dois subtipos de macrófagos, M1 (pró-inflamatória) e M2 (anti-inflamatório). As culturas primárias de M1 e M2 macrófagos foram obtidos a partir da diferenciação de monócitos como publicado anteriormente 7.
O procedimento de eletroforese em gel 2D DIGE requer materiais e equipamentos especializados, como o IEF celular para placas isoelectrofocusing, baixa fluorescência para a SD…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Materials
| Name | Company | Catalog number |
| RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
| PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
| L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
| gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
| human serum | Invitrogen | 34005100 |
| Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
| Leucosep | Dutscher | 16760 |
| 6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
| IL-4 | Promocell | B-61410 |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
| Giemsa | Fluka | 48900 |
| EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
| Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
| 100 mL cylinder | Corning | 430182 |
| TCEP | Interchim | UP242214 |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
| Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
| IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
| Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
| Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
| Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
| Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
| Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a |
| CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
| Urée | Merk | 108484-500 |
| Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
| DTT | Bio-Rad | 1610611 |
| APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
| Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
| SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
| Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
| 2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
| Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
| electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |
Riferimenti
- van Ginderachter, J. A., et al. Classical and alternative activation of mononuclear phagocytes: picking the best of both worlds for tumor promotion. Immunobiology. 211, (2006).
- Porcheray, F., et al. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. Clin. Exp. Immunol. 142, 481-489 (2005).
- Gordon, S. Alternative activation of macrophages. Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).
- Mantovani, A., Locati, M., Vecchi, A., Sozzani, S., Allavena, P. Decoy receptors: a strategy to regulate inflammatory cytokines and chemokines. Trends Immunol. 22, 328-336 (2001).
- Pinet, F., et al. Morphology, homogeneity and functionality of human monocytes-derived macrophages. Cell. Mol. Biol. 49, 899-905 (2003).
- Boyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1. 97, 77-89 (1968).
- Chinetti-Gbaguidi, G., et al. Human atherosclerotic plaque alternative macrophages display low cholesterol handling but high phagocytosis because of distinct activities of the PPARγ and LXRα pathways. Circ. Res. 108, 985-995 (2011).
- Tonge, R., et al. Validation and development of fluorescence two-dimensional differential gel electrophoresis proteomics technology. Proteomics. 1, 377-396 (2001).
- Shaw, J., et al. Evaluation of saturation labelling two-dimensional difference gel electrophoresis fluorescent dyes. Proteomics. 3, 1181-1195 (2003).
- Dupont, A., et al. Application of saturation dye 2D DIGE proteomics to characterize proteins modulated by oxidized low density lipoprotein treatment of human macrophages. J. Proteome Res. 7, 3572-3582 (2008).
- Dupont, A., et al. Two-dimensional maps and databases of the human macrophage proteome and secretome. Proteomics. 4, 1761-1778 (2004).
- Acosta-Martin, A. E., et al. Impact of incomplete DNase I treatment on human macrophage analysis. Proteomics Clin. Appl. 3, 1236-1246 (2009).
- Acosta-Martin, A. E., Lane, L. Combining bioinformatics and MS-based proteomics: clinical implications. Expert Rev Proteomics. , (2014).
- Boytard, L., et al. Role of proinflammatory CD68+MR- macrophages in peroxiredoxin-1 expression and in abdominal aortic aneurysms in humans. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 33, 431-438 (2013).
