Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.
The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.
मैक्रोफेज विशिष्ट कार्यात्मक फेनोटाइप हासिल करने में सक्षम हैं कि विषम और प्लास्टिक कोशिकाओं रहे हैं. में विवो, इन कोशिकाओं माइक्रोबियल उत्पादों, साइटोकिन्स, आदि. 1 के रूप में सूक्ष्म पर्यावरण signalssuch की एक विशाल विविधता का जवाब. इन विट्रो, समर्थक भड़काऊ फेनोटाइप (एम 1) मैक्रोफेज की lipopolysaccharide (LPS) और इस तरह के इंटरल्यूकिन -4 (आईएल 4) के रूप में कुछ साइटोकिन्स से विरोधी भड़काऊ फेनोटाइप (M2) के द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. इसके अलावा, मैक्रोफेज विशिष्ट संकेत 2 पर, इसके विपरीत M2 के phenotype के लिए एक सक्रिय एम 1 से स्विच, और कर सकते हैं.
फेनोटाइप पर निर्भर करता है, मैक्रोफेज अलग कार्य किया जाएगा. एम 1 मैक्रोफेज सूक्ष्मजीवों या ट्यूमर कोशिकाओं 3 को मारने के लिए, इस तरह के ट्यूमर परिगलन कारक α (TNF-α) के रूप में समर्थक भड़काऊ साइटोकिन्स, उत्पादन कि कोशिकाओं रहे हैं. इसके विपरीत, M2 मैक्रोफेज विरोधी inflammator उत्पादन से घाव भरने और फाइब्रोसिस में तरह इन भड़काऊ प्रतिक्रिया को रोकने केऐसे 3,4 TGF-β रूप Y कारकों.
पहले से Boyum 6 से अनुकूलित एक तकनीक का उपयोग कर 5 में वर्णित के रूप में स्वस्थ दाताओं से मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear Ficoll घनत्व ढाल centrifugation द्वारा अलग थे. संस्कृति में मैक्रोफेज प्राथमिक संस्कृति 7 के 6 दिन बाद एम 1 या M2 फेनोटाइप में भेदभाव किया जा सकता.
प्रोटीन अभिव्यक्ति या ऐसे मेजबान pathogenicity या माइक्रोबियल विषाक्त पदार्थों के रूप में विभिन्न नियंत्रित उत्तेजनाओं, के तहत मैक्रोफेज की दो उपप्रकार के बीच प्रोटीन परिवर्तन का विश्लेषण, समर्थक और विरोधी भड़काऊ मैक्रोफेज की कार्यक्षमता को समझने के लिए मददगार होगा.
प्रोटिओमिक्स विशेष रूप से ऊपर या विभिन्न उत्तेजनाओं के तहत मानव सुसंस्कृत मैक्रोफेज में नीचे विनियमित हैं कि प्रोटीन की प्रत्यक्ष निगरानी के लिए अद्वितीय उपकरण हैं. फ्लोरोसेंट रंजक इतनी कम संवेदनशीलता और छवि विश्लेषण के रूप में 8 2 डी जेल वैद्युतकणसंचलन की सीमाओं में से कुछ को हल है < / समर्थन>. सिस्टीन अवशेषों के साथ प्रतिक्रिया रंगों लाइसिन अवशेषों 9 के साथ प्रतिक्रिया उन लोगों की तुलना का पता लगाने संवेदनशीलता बढ़ गई है. पिछले एक अध्ययन में, हम शास्त्रीय चांदी से सना हुआ 2 डी वैद्युतकणसंचलन 11 की तुलना में दुर्लभ नमूने 10 के विश्लेषण के लिए DIGE संतृप्ति लेबलिंग की उपयोगिता का प्रदर्शन किया. इस प्रौद्योगिकी के तेजी से मैक्रोफेज की दो उपप्रकार के बीच या एक ही उप प्रकार से इलाज और इलाज मैक्रोफेज के बीच प्रोटीन संशोधनों का विश्लेषण करने में सहायक है.
इस प्रोटिओमिक तकनीक के फायदे 2 डी जेल 12 विश्लेषण करके प्रोटीन आकार और बाद translational संशोधनों की जानकारी के लिए उपयोग कर रहे हैं. यह विश्लेषण किया जा सकता है कि नमूनों की संख्या सीमित है, यह एक उच्च throughput तकनीक नहीं है कि ध्यान में रखा जाना चाहिए. मास स्पेक्ट्रोमेट्री पर आधारित उच्च throughput assays के विकास की समीक्षा की के रूप में हाल ही में 13 इस सुधार कर सकते हैं.
_content "> यहाँ हम वैद्युतकणसंचलन, isoelectrofocusing की प्रक्रियाओं के माध्यम से सुसंस्कृत मैक्रोफेज के प्रोटीन निष्कर्षण से 2 डी DIGE विश्लेषण करने के लिए कैसे मौजूद है, और पर्याप्त 2 डी सॉफ्टवेयर की उपयोगिता पर एसडीएस पृष्ठ के साथ ही जानकारी.इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल मैक्रोफेज, एम 1 (समर्थक भड़काऊ) और M2 (विरोधी भड़काऊ) के दो उपप्रकार के विभिन्न उत्तेजनाओं के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए एक विधि का विवरण. पहले 7 प्रकाशित के रूप में एम …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by Inserm. Marion Bouvet is a fellow of the French Ministry for Research and Technology. Annie Turkieh is a fellow granted by European Union FP7 HOMAGE (305507).
Name | Company | Catalog number |
RPMI 1640 | Invitrogen | 31870-074 |
PBX 10 X | Invitrogen | 14200-083 |
L-glutamine-200mM-100X | Invitrogen | 25030-024 |
gentamycin 10 mg/mL | Invitrogen | 15710-049 |
human serum | Invitrogen | 34005100 |
Ficoll d=1,077 | ATGC | L6115 |
Leucosep | Dutscher | 16760 |
6-wells plate PRIMARIA | Becton Dickinson | 353846 |
IL-4 | Promocell | B-61410 |
lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | L-2654 |
Giemsa | Fluka | 48900 |
EDTA MM372,2 | Research Organics | 3.00E+01 |
Filter 0,22µm | Millipore | SCGPTORE |
100 mL cylinder | Corning | 430182 |
TCEP | Interchim | UP242214 |
Bradford reagent | Bio-Rad | 5000006 |
Cy3+Cy5-reactive dye | GE Healthcare | 25-8009-83 |
IPG strip 3-10 24cm | GE Healthcare | 17-6002-44 |
Protean IEF cell | Bio-Rad | 165-4000 |
Low-melting agarose | Invitrogen | 15517-014 |
Ettan-Daltsix system | GE Healthcare | 80-6485-08 |
Ettan DIGE Imager scanner | GE Healthcare | |
Progenesis Samespot | Non linear dynamics | |
50 ml tubes | any supplier | n/a |
15 ml tubes | any supplier | n/a |
CHAPS | Sigma-Aldrich | C5070 |
Urée | Merk | 108484-500 |
Thiourée | Sigma-Aldrich | T7875 |
DTT | Bio-Rad | 1610611 |
APS | Sigma-Aldrich | A3678 |
TEMED | Sigma-Aldrich | T9281 |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 |
Pharmalytes 3-10 | GE Healthcare | 17-0456-01 |
SDS | Sigma-Aldrich | L3773 |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 |
Acrylamide 40% | Bio-Rad | 161-0148 |
2D clean Up | GE Healthcare | 80-6454-51 |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126 |
Diméthylformamide | Sigma-Aldrich | 22705-6 |
electrode wicks | Bio-Rad | 165-4071 |