Der neuromuskulären Synapse: Mess Synapse Größe, Fragmentierung und Veränderungen der synaptischen Protein Dichte Mit der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
Die neuromuskulären Synapse (NMJ) ist die große, cholinergen Synapse Relais durch die Säugetiermotoneuronen steuern freiwilligen Muskelkontraktion. Bauliche Veränderungen an der NMJ kann bei der Neurotransmission Versagen führen, was zu Schwäche, Atrophie und sogar zum Tod der Muskelfaser. Viele Studien haben untersucht, wie genetische Veränderungen oder Krankheit kann die Struktur der Maus NMJ ändern. Leider kann es schwierig sein, direkt Erkenntnisse aus diesen Studien zu vergleichen, weil sie oft verwendet verschiedene Parameter und analytische Methoden. Drei Protokolle werden hier beschrieben. Der erste verwendet Maximum Intensity Projection konfokalen Bildern, die Fläche der Acetylcholin-Rezeptor (AChR) -reichen messen postsynaptischen Membran-Domänen an der Endplatte und der Fläche der synaptischen Vesikel-Färbung in der darüberliegenden präsynaptischen Nervenende. Das zweite Protokoll vergleicht die relativen Intensitäten der Immunfärbung für synaptische Proteine in der postsynaptischen Membran. Die dritte protocol verwendet Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), um Veränderungen in der Packung der postsynaptischen AChR an der Endplatte zu detektieren. Die Protokolle sind entwickelt worden, und über eine Reihe von Studien verfeinert. Faktoren, die die Qualität und Konsistenz der Ergebnisse beeinflussen werden diskutiert und normative Daten für NMJs bei gesunden jungen erwachsenen Mäusen zur Verfügung gestellt.
Introduction
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die kritische Relais Synapse, die eine Kommunikation zwischen dem Nervensystem und im Skelettmuskel vermittelt. Es wird für alle willkürlichen Bewegungen erforderlich. Die Fluoreszenzmikroskopie ist seit langem verwendet, um die Auswirkungen von Transgenen auf der Maus NMJ 1-3 studieren oder um die Auswirkungen von Alter, Ernährung, Bewegung und Krankheit auf Nagetier NMJs 4-11 vergleichen. Solche Studien haben uns viel über die Physiologie und Pathophysiologie der NMJ gelehrt, aber die verschiedenen Parameter angegeben (zB AChR Bereich Endplatte Fläche, Umfang Länge, Fragmentierung Indizes) machen es oft schwierig, die Ergebnisse dieser Studien zu vergleichen. Es gibt eine steigende Erwartung für die präklinische Forscher in der Lage, um die Reproduzierbarkeit zu demonstrieren, insbesondere in Studien mit Tiermodellen der Krankheit 12 sein. Die hier beschriebenen Protokolle wurden durch eine Reihe von Studien, die entwicklungsbedingten, physiologischen und pathophysiologischen ch sucht verfeinertanges auf die NMJ. Erfordern solche Untersuchungen Messung der Fläche von synaptischen Spezialisierungen an der Maus motorischen Endplatte und die relative Packungsdichte der synaptischen Proteinen innerhalb postsynaptischen Spezialisierungen 13-15.
Die Nützlichkeit dieser Verfahren wird durch jüngste Studien in einem Mausmodell von anti-MuSK Myasthenia gravis dargestellt. Tägliche Injektionen von IgG von Anti-Moschus positive Myasthenia gravis Patienten in erwachsenen Mäusen veranlasste sie, innerhalb von 2 Wochen 16 schwach werden. Die konfokale maximale Projektionsbilder von Muskelpartien, die doppelt markierten wurden Synaptophysin (in Nerven Terminals) und postsynaptischen AChRs ergab einen allmählichen Rückgang im Bereich der AChR-Färbung als primäre Veränderung. Wichtig ist der Rückgang war ausreichend, um vergleichbare Rückgänge in der Amplitude des synaptischen Potentiale, Versagen der synaptischen Übertragung und Muskelschwäche 17,18 erklären. Qualitativ ähnliche Ergebnisse wurden von anderen Arbeitsgruppen berichtet10,19. Die gleichen NMJ Meßmethoden seit verwendet worden, um die Auswirkungen der drei Medikamente zur Behandlung von anti-MuSK Myasthenia gravis Beurteilung in diesem Mausmodell 20,21.
Sitzende Alterung können zum Verlust der neuromuskulären Verbindungen führen. Die hier beschriebenen Protokolle haben eine altersbedingte Rückgang im Bereich der Nervenendigung Synaptophysin bei motorischen Endplatten zeigte Mäuse Fortschritt ins hohe Alter. Die gleichen Methoden ergab, dass freiwillige Übung konnte weitgehend verhindern, dass die Reduzierung der präsynaptischen Nervenende Bereich 22, im Einklang mit früheren Arbeiten anderer Gruppen 4. Der Verlust der neuromuskulären Verbindungen kommt auch in der SOD1G93A Mausmodell für Amyotrophe Lateralsklerose 9,23.
Die genannten Studien zeigen, dass eine Vielzahl von gesundheitlichen Bedingungen kann zu Kürzungen im Bereich der entweder vor oder nach der synaptischen Spezialisierungen an der NMJ führen. Dies kann zu einer Beeinträchtigung der synaptischen Spaß führenction oder vollständigen Verlust der neuromuskulären Verbindung ankündigen. Drei Protokolle beschrieben, die Quantifizierung der Fläche und der Dichte der synaptischen Spezialisierungen ermöglichen. Der Zweck des ersten Protokolls besteht darin, eine praktische und reproduzierbare Bestimmung der Flächen der prä- und postsynaptischen Spezialisierungen und deren Ausrichtung in Säuger NMJs bereitzustellen, unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie. Zweidimensionale maximale Projektions konfokalen Bildern und Bildanalyse mit NIH ImageJ wird verwendet, um Änderungen im Bereich des Synaptophysin-Färbung (synaptische Vesikel) postsynaptischen AChR und synaptische Überlappungsbereich zu detektieren. Konfokales Abbildungsparameter (Verstärkung und Offset-Pegel) werden für jede NMJ optimiert, um die visuellen Informationen verwendet werden, um den Bereich der synaptischen Spezialisierung erkennen maximieren. Neuromuscular Ausfall kann auch von Änderungen der Dichte des postsynaptischen AChR und / oder andere synaptische Proteine zur Folge haben. Das zweite Protokoll kann angewandt, um Änderungen in der relativen Dichte der postsynaptischen Proteine, nachzuweisenwie Moschus, Rapsyn, dystroglycan, phosphoryliert Src-Kinase phosphoryliert und AChR 18,21.
In Myasthenia gravis, ist eine reduzierte Dichte von AChR in der postsynaptischen Membran die unmittelbare Ursache der synaptischen Versagen und Muskelschwäche. Das dritte Protokoll beschreibt ein Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET), um die Veränderungen in der Nähe der benachbarten AChR innerhalb postsynaptischen Membranen 14,15 beurteilen. Diese Methode erkennt Energietransfer zwischen benachbarten AChRs mit fluoreszenz α -Bungarotoxin (BGT) gekennzeichnet. FRET tritt auf, wenn die fluoreszierenden Donor und Akzeptor-Sonden sind weniger als 10 nm auseinander liegen. Dies kann (submikroskopische) Veränderungen in der Dichtheit der AChR Verpackung, die direkt auf die Amplitude der synaptischen Potentiale beziehen können offenbaren.
Diese drei Protokolle, in der letzten Dekade raffiniert, bieten ergänzende Maßnahmen der NMJ Integrität in einer konsistenten und reproduzierbar. Verwendung standardisierter Protokolle einnd Parameter sollten Vergleich der Wirkungen von Genen und Umweltmaßnahmen auf die Säugetier NMJ erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die hier beschriebenen Protokolle konnten wir zuverlässig messen und zu quantifizieren Veränderungen in den Eigenschaften der NMJ in einer Reihe von Bedingungen, einschließlich der normalen Alterung und Krankheitszuständen. Die für en beschriebenen Methoden stellen NMJ Bilder wird es den Forschern ermöglichen, den Bereich der prä- und postsynaptischen Spezialisierungen und den Bereich der synaptischen Überlappung / Ausrichtung zu vergleichen. Um die relative Intensität der prä- und postsynaptischen Proteine ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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