La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza
Summary
The neuromuscular junction (NMJ) is altered in a variety of conditions that can sometimes culminate in synaptic failure. This report describes fluorescence microscope-based methods to quantify such structural changes.
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è il grande, sinapsi relè colinergici attraverso cui i neuroni motori mammiferi controllano la contrazione muscolare volontaria. I cambiamenti strutturali del NMJ possono causare insufficienza neurotrasmissione, con conseguente debolezza, atrofia e persino la morte della fibra muscolare. Molti studi hanno indagato come modificazioni genetiche o malattie possono alterare la struttura del NMJ mouse. Purtroppo, può essere difficile confrontare direttamente i risultati di questi studi, perché spesso utilizzati diversi parametri e metodi analitici. Tre protocolli sono descritte qui. Il primo utilizza massima intensità di proiezione immagini confocale per misurare l'area di acetilcolina recettore (AChR) ricchi di domini di membrana postsinaptici alla placca e la zona della vescicola sinaptica colorazione nella terminazione nervosa presinaptica sovrastante. Il secondo protocollo confronta le intensità relative di immunocolorazione per proteine sinaptiche nella membrana postsinaptica. Il terzo protocol utilizza Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per rilevare i cambiamenti nel confezionamento di AChRs postsinaptici alla placca. Sono stati sviluppati e raffinato in una serie di studi I protocolli. I fattori che influenzano la qualità e la coerenza dei risultati vengono discussi e dati normativi sono previste NMJs in soggetti sani giovani topi adulti.
Introduction
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi relè critico che media la comunicazione tra il sistema nervoso e muscolo scheletrico. E 'richiesto per tutti i movimenti volontari. La microscopia a fluorescenza è stato a lungo utilizzato per studiare gli effetti della transgeni del mouse NMJ 1-3 o per confrontare gli effetti di età, la dieta, esercizio fisico e le malattie sul NMJs roditori 4-11. Tali studi hanno insegnato molto sulla fisiologia e fisiopatologia della NMJ, ma i diversi parametri segnalati (ad esempio, zona AChR, zona endplate, la lunghezza del perimetro, indici di frammentazione) spesso rendono difficile il confronto dei risultati di questi studi. C'è un'aspettativa crescente per i ricercatori pre-clinici per essere in grado di dimostrare la riproducibilità, in particolare in studi con modelli di roditori di malattia 12. I protocolli descritti qui sono state affinate attraverso una serie di studi che ha indagato sviluppo, fisiologico e fisiopatologico changes al NMJ. Tali studi richiedono misurazione della zona di specializzazioni sinaptiche alla placca motore mouse e la densità relativa di imballaggio, di proteine sinaptiche all'interno specializzazioni postsinaptici 13-15.
L'utilità di questi metodi è illustrato da studi recenti in un modello murino di anti-MuSK miastenia gravis. Iniezioni giornaliere di IgG da miastenia anti-MuSK-positivi gravis pazienti in topi adulti hanno causato loro di diventare deboli entro 2 settimane 16. Confocale immagini di massima proiezione di sezioni muscolari che sono stati doppio etichettati per sinaptofisina (in nervosi terminali) e post-sinaptici AChRs rivelato un progressivo declino nella zona del recettore colorazione come il cambiamento primario. È importante sottolineare che il tasso di declino è stato sufficiente a spiegare calo comparabili in ampiezza dei potenziali sinaptici, il fallimento della trasmissione sinaptica e debolezza muscolare 17,18. Qualitativamente Risultati simili sono stati riportati da altri gruppi di ricerca10,19. Gli stessi metodi di misurazione NMJ allora sono stati utilizzati per valutare l'impatto di tre farmaci per il trattamento anti-MuSK miastenia grave in questo modello di topo 20,21.
Invecchiamento sedentario può portare alla perdita di connessioni neuromuscolari. I protocolli descritti hanno rivelato un declino associato all'età in materia di terminazione nervosa synaptophysin a placche motrici come topi progrediscono in età avanzata. Gli stessi metodi hanno rivelato che l'esercizio fisico volontario potrebbe in gran parte prevenire la riduzione della zona terminale nervoso presinaptico 22, in linea con il lavoro precedente di altri gruppi 4. La perdita delle connessioni neuromuscolari si verifica anche nel modello murino SOD1G93A di sclerosi laterale amiotrofica 9,23.
Gli studi di cui sopra dimostrano che una varietà di condizioni di salute può portare a riduzioni in materia di specializzazioni sia pre o post-sinaptici al NMJ. Ciò può comportare divertimento sinaptica alterataction o può preannunciare la perdita completa della connessione neuromuscolare. Tre protocolli sono descritte che permettono quantificazione della superficie e la densità di specializzazioni sinaptici. Lo scopo del primo protocollo è quello di fornire una misura pratica e riproducibile delle aree di pre e post-sinaptici specializzazioni e il loro allineamento a NMJs di mammifero, utilizzando microscopia a fluorescenza. Bidimensionali immagini massimi proiezione confocale e analisi di immagine con NIH ImageJ è utilizzato per rilevare i cambiamenti nel settore della sinaptofisina colorazione (vescicole sinaptiche), AChRs post-sinaptici e area di sovrapposizione sinaptica. Parametri confocale (gain e offset di livello) sono ottimizzati per ogni NMJ in modo da massimizzare le informazioni visive utilizzate per discernere l'area di specializzazione sinaptica. Insufficienza neuromuscolare può anche derivare da variazioni di densità del recettore postsynaptic e / o di altre proteine sinaptiche. Il secondo protocollo può essere applicata per rilevare variazioni nella densità relativa di proteine postsinaptici talicome muschio, rapsyn, distroglicano, fosforilata Src chinasi e fosforilata AChR 18,21.
In miastenia grave, una densità ridotta del recettore nella membrana post-sinaptica è la causa immediata del fallimento sinaptica e debolezza muscolare. Il terzo protocollo descrive un metodo Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per valutare i cambiamenti in prossimità di AChRs adiacenti all'interno delle membrane postsinaptiche 14,15. Questo metodo rileva il trasferimento di energia tra AChRs vicini etichettati con fluorescenti-α-bungarotossina (BGT). FRET avviene solo quando le sonde donatore e accettore fluorescenti sono meno di 10 nm a parte. Questo può rivelare (submicroscopiche) delle modifiche, la tenuta di AChR imballaggio che possono riguardare direttamente l'ampiezza dei potenziali sinaptici.
Questi tre protocolli, raffinati negli ultimi dieci anni, prevedono misure complementari di integrità NMJ in modo coerente e riproducibile. L'utilizzo di protocolli standardizzati unParametri nd dovrebbero facilitare il confronto degli effetti di geni e interventi ambientali su mammifero NMJ.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti qui ci hanno permesso di misurare in modo affidabile e quantificare i cambiamenti nelle proprietà del NMJ tutta una serie di condizioni, tra cui l'invecchiamento e le malattie normali stati. I metodi descritti per en face immagini NMJ consentiranno ai ricercatori di confrontare l'area di specializzazioni pre- e post-sinaptici e la zona di sinaptica sovrapposizione / allineamento. Per confrontare l'intensità relativa di proteine pre- e post-sinaptici il secondo protocollo, che u…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Health and Medical Research Council [570930]. Imaging was carried out at the Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Former members of the lab, whose work is cited, are thanked for their contributions to developing these methods.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Scanning confocal microscope | Leica | DM IRE2 with TCS SP2 system | Most scanning confocal microscopes should be suitable. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotoxin (red-BGT) | Life technologies | B35451 | Used for labelling AChRs |
| Alexa647-α-bungarotoxin (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Far red fluorescence: barely visible through the eyepiece |
| rabbit anti-synaptophysin | Life technologies | 18-0130 | Different batches of primary antibody differ in effective working dilution |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Monoclonal antibody conjugated to FITC |
| FITC-donkey anti-rabbit IgG | Jackson | 711-095-152 | Polyclonal secondary antibodies can vary in quality according to source and batch |
| Optimal Cutting Temperature compound (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Cryostat embedding matrix for freezing muscles |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mounting medium that slows photobleaching of fluorophors |
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