La giunzione neuromuscolare (NMJ) è alterata in una varietà di condizioni che a volte possono culminare in un fallimento sinaptico. Questo rapporto descrive i metodi basati sul microscopio a fluorescenza per quantificare tali cambiamenti strutturali.
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Articolo metodologico
La giunzione neuromuscolare: Synapse Misurazione circonferenza, la frammentazione e Variazioni Synaptic Proteine Densità Uso confocale microscopia a fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è il grande, sinapsi relè colinergici attraverso cui i neuroni motori mammiferi controllano la contrazione muscolare volontaria. I cambiamenti strutturali del NMJ possono causare insufficienza neurotrasmissione, con conseguente debolezza, atrofia e persino la morte della fibra muscolare. Molti studi hanno indagato come modificazioni genetiche o malattie possono alterare la struttura del NMJ mouse. Purtroppo, può essere difficile confrontare direttamente i risultati di questi studi, perché spesso utilizzati diversi parametri e metodi analitici. Tre protocolli sono descritte qui. Il primo utilizza massima intensità di proiezione immagini confocale per misurare l'area di acetilcolina recettore (AChR) ricchi di domini di membrana postsinaptici alla placca e la zona della vescicola sinaptica colorazione nella terminazione nervosa presinaptica sovrastante. Il secondo protocollo confronta le intensità relative di immunocolorazione per proteine sinaptiche nella membrana postsinaptica. Il terzo protocol utilizza Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per rilevare i cambiamenti nel confezionamento di AChRs postsinaptici alla placca. Sono stati sviluppati e raffinato in una serie di studi I protocolli. I fattori che influenzano la qualità e la coerenza dei risultati vengono discussi e dati normativi sono previste NMJs in soggetti sani giovani topi adulti.
Introduzione
La giunzione neuromuscolare (NMJ) è la sinapsi relè critico che media la comunicazione tra il sistema nervoso e muscolo scheletrico. E 'richiesto per tutti i movimenti volontari. La microscopia a fluorescenza è stato a lungo utilizzato per studiare gli effetti della transgeni del mouse NMJ 1-3 o per confrontare gli effetti di età, la dieta, esercizio fisico e le malattie sul NMJs roditori 4-11. Tali studi hanno insegnato molto sulla fisiologia e fisiopatologia della NMJ, ma i diversi parametri segnalati (ad esempio, zona AChR, zona endplate, la lunghezza del perimetro, indici di frammentazione) spesso rendono difficile il confronto ....
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Protocollo
NOTA: Progettazione, gestione e rendicontazione di esperimenti sugli animali dovrebbero tenere conto degli orientamenti attuali 24. Tale lavoro deve essere preventivamente approvato dalle autorità locali il benessere degli animali (nel nostro caso il comitato della University of Sydney Etica Animale).
1. L'eutanasia dell'animale e Muscle Dissection
- Trasferire il mouse dalla camera di conservazione ad una camera separata dove è eutanasia con una iniezione intraperitoneale di soluzione pentobarbitone (30 mg / kg) utilizzando il metodo di movimentazione del mouse dettagliato da Shimizu 25. Posizionare il mouse di nuovo nella sua ....
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Risultati
Misura di Synaptic Area al NMJ
Qualsiasi stima della zona si basa sul disegno di un contorno per definire l'estensione di specializzazioni sinaptici. Nei giovani adulti sani muscoli immagini NMJ dovrebbero visualizzare i confini ben definiti sia per AChR e synaptophysin colorazione (Figura 2A e B). Intensità di fluorescenza sia per AChR e synaptophysin aumenta sensibilmente al confine tra la porzione peri-sinaptica e sinaptica del endplate m.......
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Discussione
I protocolli descritti qui ci hanno permesso di misurare in modo affidabile e quantificare i cambiamenti nelle proprietà del NMJ tutta una serie di condizioni, tra cui l'invecchiamento e le malattie normali stati. I metodi descritti per en face immagini NMJ consentiranno ai ricercatori di confrontare l'area di specializzazioni pre- e post-sinaptici e la zona di sinaptica sovrapposizione / allineamento. Per confrontare l'intensità relativa di proteine pre- e post-sinaptici il secondo protocollo, che utilizz.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Health and Medical Research Council [570930]. L'imaging è stato effettuato presso la Bosch Institute Advanced Microscopy Facility. Si ringraziano gli ex membri del laboratorio, il cui lavoro è citato, per il loro contributo allo sviluppo di questi metodi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio confocale a scansione | Leica | DM 2000 con Sistema TCS SP2 | La maggior parte dei microscopi confocali a scansione dovrebbe essere adatta. |
| Zeiss | LSM 510 Meta | ||
| Leica | SPE-II | ||
| Alexa555-a-bungarotossina (rosso-BGT) | Life technologies | B35451 | Utilizzato per l'etichettatura AChRs |
| Alexa647-α-bungarotossina (far-red-BGT) | Life technologies | B35450 | Fluorescenza rossa lontana: appena visibile attraverso l'oculare |
| coniglio anti-sinaptofisina | Life technologies | 18-0130 | Diversi lotti di anticorpi primari differiscono per l'efficace diluizione di lavoro |
| FITC-anti-rapsyn mab1234 | Milipore | FCMAB134F | Anticorpo monoclonale coniugato a FITC |
| FITC-asino anti-coniglio IgG | Jackson | 711-095-152 | Gli anticorpi policlonali secondari possono variare in qualità a seconda della fonte e del lotto |
| Temperatura di taglio ottimale composto (O.T.C.) | ProSciTech | IA018 | Matrice di inclusione del criostato per il congelamento dei muscoli |
| DABCO | Sigma | 10981 | Mezzo di montaggio che rallenta il fotosbiancamento dei fluorofori |
Riferimenti
- Schmidt, N., et al. Neuregulin/ErbB regulate neuromuscular junction development by phosphorylation of α-dystrobrevin. J Cell Biol. 195, 1171-1184 (2011).
- Amenta, A. R., et al. Biglycan is an extracellular MuSK binding ....
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Ristampe e permessi
