La luce allo xeno non coerente è stata fatta passare attraverso filtri di interferenza a banda stretta e densità neutra per fornire luce di lunghezza d'onda e intensità variabili alle cellule in coltura. Questo protocollo è stato utilizzato per valutare gli effetti della terapia con luce rossa/vicino infrarosso sulla produzione di specie reattive in vitro: non sono stati osservati effetti utilizzando i parametri testati.
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Articolo metodologico
Metodo per la valutazione degli effetti di un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di / vicino-infrarosso di terapia della luce rossa sullo stress ossidativo In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Red / terapia della luce nel vicino infrarosso (R / NIR-LT), consegnato da laser o diodi emettitori di luce (LED), migliora i risultati funzionali e morfologiche a una serie di lesioni del sistema nervoso centrale in vivo, possibilmente riducendo lo stress ossidativo. Tuttavia, gli effetti di R / NIR-LT sullo stress ossidativo hanno dimostrato di variare a seconda lunghezza d'onda o intensità di irraggiamento. Gli studi che confrontano parametri di trattamento mancano, a causa della mancanza di dispositivi disponibili in commercio in grado di offrire di più lunghezze d'onda o intensità, adatti per alta through-put in studi di ottimizzazione in vitro. Questo protocollo descrive una tecnica per la consegna di luce in un intervallo di lunghezze d'onda e intensità di ottimizzare dosi terapeutiche richieste per un determinato modello di lesione. Abbiamo ipotizzato che un metodo di fornire luce, in cui i parametri di lunghezza d'onda e intensità potrebbero facilmente essere alterati, potrebbe facilitare la determinazione di una dose ottimale di R / NIR-LT per ridurre le specie reattive dell'ossigeno(ROS) in vitro.
Non coerente Xenon è stata filtrata attraverso filtri interferenziali a banda stretta per offrire lunghezze d'onda diverse lunghezze d'onda (centro di 440, 550, 670 e 810 nm) e fluenze (8,5 x 10 -3 a 3,8 x 10 -1 J / cm 2) della luce a cellule in coltura. L'emissione luminosa dall'apparato è stato calibrato per emettere terapeuticamente rilevanti, dosi uguali quantali di luce ad ogni lunghezza d'onda. Specie reattive sono state rilevate in glutammato sottolineato cellule trattate con la luce, utilizzando DCFH-DA e H 2 O 2 coloranti fluorescenti sensibili.
Abbiamo consegnato con successo luce in una gamma di lunghezze d'onda fisiologicamente e terapeuticamente e intensità rilevanti, a cellule in coltura esposte a glutammato come modello di lesioni del sistema nervoso centrale. Mentre le influenze di R / NIR-LT utilizzati in questo studio non esercitare un effetto sulla ROS generato dalle cellule in coltura, il metodo di consegna luce è applicabile ad altri systems compresi mitocondri o più fisiologicamente rilevanti modelli cultura fetta organotipiche isolate, e potrebbe essere utilizzato per valutare gli effetti su una serie di misure di outcome del metabolismo ossidativo.
Introduzione
Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono necessari per una serie di trasduzione del segnale e le normali reazioni del metabolismo cellulare, inclusi quelli di neuroprotezione 1. Tuttavia, quando il meccanismo endogeno antiossidante sono in grado di controllare la produzione di ROS, le cellule possono soccombere allo stress ossidativo 2,3. Dopo lesioni al sistema nervoso centrale, gli aumenti legati in presenza di ROS e lo stress ossidativo sono pensati per svolgere un ruolo importante nella progressione del danno 4,5. Nonostante l'ampio numero di strategie per attenuare lo stress ossidativo che sono stati valutati, non vi s....
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Protocollo
1. ottico di calibrazione: misurazione della luce emessa
- Per preparare l'apparato consegna luce, collegare una sorgente di luce a banda larga (ad esempio, o lampada Xenon tungsteno) ad un'alimentazione adeguata. Posizionare una lente collimatrice di fronte alla sorgente di luce per produrre un fascio collimato di luce. Passare la luce attraverso un filtro di calore liquido per rimuovere la maggior parte del calore dal fascio di luce. A seconda dell'applicazione, concentrare il fascio collimato al diaframma all'ingresso di una guida di luce liquida, che prevede la consegna più flessibile della luce (ad es., In un incubatore).
- All....
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Risultati
L'uscita di luce emesso alla lunghezza d'onda di 670nm è stato calibrato utilizzando filtri di densità neutri per irradiare le cellule con una gamma di fluenze che comprende una dose di luce 670nm precedentemente dimostrato di essere utile in vivo (0,3 J / cm 2) 20. Poiché il numero di filtri di densità neutri di fronte alla sorgente luminosa aumentata, l'intensità (W / m 2) è diminuita, con meno luce che passa per l'area di destinazione. Tabella 1 presenta i dati di calibrazione di luce 6.......
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Discussione
Abbiamo adattato con successo un sistema di erogazione precisa della luce e tarato per fornire un meccanismo per lo studio di ottimizzazione di R / NIR-LT in vitro. Lunghezza d'onda e intensità di parametri R / NIR-LT sono in grado di essere manipolato accuratamente ed efficacemente usando questo sistema. Abbiamo stabilito che la luce il trattamento delle cellule non ha portato alla morte delle cellule, anche se ROS non sono stati ridotti alle lunghezze d'onda e dosaggi consegnati, nei tipi cellulari te.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal Programma di Ricerca sui Neurotraumi (Australia Occidentale). Questo progetto è finanziato attraverso il Road Trauma Trust Account, ma non riflette le opinioni o le raccomandazioni del Road Safety Council.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di analisi intracellulare ROS OxiSelect (fluorescenza verde) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| Lampada ad arco allo xeno da 300 Watt | Newport Corporation | 6258 | Sorgente luminosa molto intensa, non guardare direttamente nella lampada. Assicurarsi che la lampada sia sufficientemente raffreddata mentre è accesa |
| Spettrometro a fluorescenza USB4000-FL | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Correttore del coseno per la raccolta delle emissioni | Ocean Optics | ||
| 200μ fibra ottica di quarzo di diametro m | SpectraSuite | ||
| Ocean Optics | |||
| 2300 EnSpire Lettore di piastre multimodale | Perkin Elmer | ||
| Pierce Kit di analisi delle proteine BCA | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Tossicità acuta, indossare guanti durante la manipolazione. |
| Acido L-glutammico sale monosodico idrato | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anidro) | |
| Feocromocitoma midollo surrenale di ratto (PC12) cellule | Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Siero fetale bovino, certificato, inattivato termicamente, origine USA | Gibco | 10082-147 | Caldo a 37 gradi C a bagnomaria prima dell'uso |
| Siero di cavallo, origine neozelandese | Gibco | 16050-122 | Caldo a 37 gradi C a bagnomaria prima dell'uso |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Caldo a 37 gradi C a bagnomaria prima dell'uso |
| 100 mM di Piruvato di Sodio | Gibco | 11360-070 | Caldo a 37 gradi C a bagnomaria prima dell'uso |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Caldo a 37 gradi; C a bagnomaria prima dell'uso |
| 100X MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali | Gibco | 11140-050 | Caldo a 37 gradi C in bagnomaria prima dell'uso |
| Cellule Retinal Muller (rMC1) | Università della California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Caldo a 37 ° C a bagnomaria prima dell'uso |
| 75 cm2 Flaconi | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Bromidrato di poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquotare e conservare a -20 ° C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Caldo a 37 gradi C in bagnomaria prima dell'uso |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Gibco | 10010-049 | Caldo a 37 gradi C a bagnomaria prima dell'uso |
| Laminin Proteina di topo, | Gibco | 23017-015 | Aliquotare e conservare a -20 ° C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Caldo a 37 gradi C a bagnomaria prima dell'uso |
| Soluzione di Trypan Blue, 0,4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papaina | Worthington | ||
| L-Cisteina | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning Piastre a 96 pozzetti, fondo trasparente, nero | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Piastre a 96 pozzetti in polistirene trasparente non trattate; Forma del pozzo: rotondo; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Altalena Rocker | da laboratorio epuipment | ||
| Centrifuga | da laboratorio epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| FL441.6-10 | |||
| 550 nm Filtro passa-banda | THORLABS | FB550-10 | |
| Filtro passa-banda 670 nm | THORLABS | FB670-10 | |
| Filtro passa-banda 810 nm | THORLABS | FB810-10e | |
| Non montato Ø Filtri a Densità Neutra Assorbente 25 mm (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Non Montato Ø Filtri a Densità Neutra Assorbente 25 mm (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Non Montato Ø Filtri a Densità Neutra Assorbente 25 mm (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Non Montato Ø Filtri a Densità Neutra Assorbente 25 mm (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Non Montato Ø Filtri a Densità Neutra Assorbente 25 mm (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Non Montato Ø Filtri a densità neutra assorbente da 25 mm (1.0) | THORLABS | NE10B |
Riferimenti
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signalin....
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