Abstract
Rood / nabij-infrarood licht therapie (R / NIR-LT), laser of licht emitterende diode (LED) afgeleverd, verbetert de functionele en morfologische resultaten bij verschillende centraal zenuwstelsel letsels in vivo, waarschijnlijk door het verminderen van oxidatieve stress. Echter, zijn effecten van R / NIR-LT op oxidatieve stress is aangetoond variëren naargelang de golflengte of sterkte van de straling. Studies behandeling parameters te vergelijken ontbreken, door het ontbreken van commercieel beschikbare apparaten die meerdere golflengtes of intensiteiten, geschikt voor high-throughput in vitro optimalisatie studies leveren. Dit protocol beschrijft een techniek voor de levering van licht bij verschillende golflengten en intensiteiten therapeutische doses die voor een bepaalde traumamodel optimaliseren. Onze hypothese was dat een werkwijze voor het afgeven licht, waarbij golflengte en intensiteit parameters eenvoudig kunnen worden veranderd, kan bepaling van een optimale dosis van R / NIR-LT voor het verminderen reactieve zuurstof species bevorderen(ROS) in vitro.
Niet-coherente Xenon licht werd gefilterd door smalband interferentie filters aan variërende golflengten (centrum golflengtes van 440, 550, 670 en 810nm) en invloeden te leveren (8,5 x 10 -3 tot 3,8 x 10 -1 J / cm2) van het licht gekweekte cellen. Lichtopbrengst van het apparaat werd gekalibreerd om therapeutisch relevante, gelijk quantale doses van licht uitzenden bij elke golflengte. Reactieve soorten werden gedetecteerd in glutamaat gewezen cellen behandeld met het licht, met DCFH-DA en H 2 O 2 fluorescente kleurstoffen.
We succesvol afgeleverd licht bij diverse fysiologisch en therapeutisch relevante golflengten en intensiteiten gekweekte cellen blootgesteld aan glutamaat als een model van CNS letsel. Hoewel de invloeden van R / NIR-LT gebruikt in de onderhavige studie geen effect op ROS geproduceerd door de gekweekte cellen te oefenen, de wijze van licht levering voor andere systEMS waaronder geïsoleerde mitochondria of meer fysiologisch relevante organotypische slice cultuur modellen, en kan worden gebruikt om effecten op verschillende uitkomstmaten van oxidatief metabolisme te beoordelen.
Introduction
Reactieve zuurstof species (ROS) zijn vereist voor verschillende signaaltransductieroutes en normale reacties van cellulair metabolisme, waaronder neuroprotectie 1. Wanneer echter endogene antioxidant mechanisme in staat zijn de productie van ROS controleren kunnen cellen bezwijken oxidatieve stress 2,3. Na letsel aan het CZS, zijn de stijgingen van de aanwezigheid van ROS en oxidatieve stress gedacht een belangrijke rol in de progressie van schade 4,5 spelen. Ondanks het grote aantal strategieën voor het verzwakken van oxidatieve stress die ervan zijn er nog geen volledig effectief klinisch relevante anti-oxidant strategieën voor het verzwakken ROS productie en geassocieerde oxidatieve stress in klinisch gebruik na neurotrauma 6. Daarom is de demping van oxidatieve stress blijft een belangrijk doel voor therapeutische interventie 7.
Verbeteringen volgening R / NIR-LT gemeld bij diverse verwondingen en ziekten waaronder vermindering cardiale infarctgrootte, nier- en hepatische complicaties bij diabetes, retinale degeneratie, CNS letsel en beroerte 8, bijvoorbeeld door het verminderen van oxidatieve stress. Met bijzondere aandacht voor CNS letsel, hebben preklinische studies van werkzaamheid van 670nm licht goede effecten in modellen van retinale degeneratie 9-11, dwarslaesie 12, neuronale dood 13 getoond. Klinische studies zijn uitgevoerd voor de droge leeftijdsgebonden maculaire degeneratie en zijn momenteel aan de gang voor een beroerte 14, maar de uitkomsten van deze onderzoeken niet lijken veelbelovend, misschien te wijten aan een gebrek aan effectieve behandeling in dienst parameters 15. Als zodanig R / NIR-LT niet wijd goedgekeurd als onderdeel van de normale klinische praktijk in neurotrauma, ondanks een gemakkelijk toe te dienen, niet-invasieve en relatief goedkope behandeling. Belemmeringen voor de klinische vertaling verschillende ontbreken van een clvroeg begreep werkingsmechanisme en het ontbreken van een gestandaardiseerd effectieve behandeling protocol 16,17. Huidige literatuur over lichttherapie blijkt dat er een overvloed aan variatie in de behandeling parameters met betrekking tot de bestraling bronnen (LED of laser), golflengte (bijvoorbeeld 630, 670, 780, 810, 830, 880, 904nm), totale dosis (joules van bestraling / oppervlakte-eenheid), de duur (belichtingstijd), timing (pre- of post- belediging), behandeling frequentie en wijze van levering (puls of continue) 8. De variabiliteit in behandeling parameters tussen studies maakt vergelijking moeilijk en heeft bijgedragen aan de scepsis ten aanzien van de werkzaamheid 16.
Daarom wordt de optimalisatie van R / NIR-LT duidelijk vereist, met celkweek systemen in staat om de high-throughput screening mechanisme nodig om de meerdere variabelen te vergelijken bieden. Er zijn echter weinig in de handel verkrijgbaar verlichting systemen die voldoende flexibiliteit en controle over wa kan biedenvelength en intensiteit van dergelijke optimalisatie experimenten. Commercieel verkrijgbare LED inrichtingen algemeen niet in staat om meerdere golflengten of intensiteiten, waardoor onderzoekers gebruik meerdere LED-inrichtingen van verschillende fabrikanten, die kunnen variëren niet alleen de intensiteit leveren, maar ook het spectrum van de golflengte van het uitgestraalde licht. We hebben dit probleem aangepakt door het gebruik van een breedband Xenon lichtbron gefilterd door smalbandinterferentie filters, waardoor een gebied van golflengten en invloeden van licht genereren, waardoor afsluiten, nauwkeurige regeling van de parameters van R / NIR-LT.
Het is belangrijk op te merken dat de therapeutische dosis van de behandeling wordt bepaald door het aantal fotonen interactie met de photoacceptor (chromofoor), die, in het geval van R / NIR-LT is gepostuleerd om cytochroom c oxidase (COX) 18. Foton energie geleverd varieert met de golflengte; betekent gelijke doses van energie bij verschillende golflengten zal comgewaardeerde verschillende aantallen fotonen. Daarom is het licht uitgezonden door de inrichting werd geijkt met een gelijk aantal fotonen uitzenden voor elk van de gekozen golflengten te testen. We hebben een systeem dat kan worden gebruikt om R / NIR-LT leveren tegen een gebied van golflengten en intensiteiten cellen in vitro ontwikkelde en de mogelijkheid aangetoond om de effecten van de geleverde R / NIR-LT op ROS productie in cellen blootgesteld meten glutamaat stress.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optische Calibration: Meten Light Output
- Aan het licht leveringapparaat bereiden, sluit een lichtbron breedband (bv Xenon of wolfraam lamp) op een geschikte voeding. Plaats een collimatorlens voor de lichtbron een gecollimeerde lichtbundel te produceren. Leid de licht door een vloeistof warmtefilter de meeste warmte uit de lichtbundel te verwijderen. Afhankelijk van de toepassing, de focus van de gerichte lichtstraal op naar de ingang opening van een vloeistof lichtgeleider, die voorziet in meer flexibele levering van het licht (bijv., In een incubator).
- Aan het andere uiteinde van het vloeibare lichtgeleider achtereenvolgens een tweede collimatorlens en een houder voor interferentie en grijsfilters. Controleer dat deze regeling levert een gelijkmatig verlichte plek van het licht van de gewenste golfgebied en intensiteit.
Opmerking: De afstand tussen het uiteinde van de lichtgeleider en het monstervlak wellicht afhankelijkhet gebied dat moet worden verlicht, maar vergeet dat naarmate de afstand tot het einde van de lichtgeleider toeneemt, zal de lichtintensiteit afnemen. In de onderhavige studie, deze afstand is 14 cm en vormt een balk dwarsdoorsnede die gelijkmatig verlicht een 3x3 putruimte op een 96-well plaat. - Zorg ervoor dat strooilicht van de lamp en de bijbehorende optische componenten niet in staat is om het monster te bereiken.
- Zet de waterkoeler voor de vloeibare hitte filter en zorgen voor uitwisseling van water door het filter jas. Zet de lamp voedingsbron en wacht minstens 5 minuten voor de breedband-lichtbron te stabiliseren. Opmerking: Het gebruik van de waterkoeler moet oververhitting van het apparaat te voorkomen.
- Selecteer een smalbandinterferentie filter (gewoonlijk beschreven door de centrale golflengte, piek transmittantie en breedte op halve hoogte (FWHM) bandbreedte) om het gewenste golfgebied van verlichting genereren. Opmerking: de smalbandige interferentiefilters gebruikt in de huidige studie werden 442 nm, 550 nm, 671 nm en 810 nm.
- Meet de door de lamp op het gebied waar het monster tijdens de behandeling te worden gepositioneerd licht. Meet licht met behulp van een gekalibreerde bestralingssterkte probe (cosinus collector) aangesloten aan een spectroradiometer behulp correctheid software volgens de instructies van de fabrikant.
- Gebruik grijsfilters om de lichtintensiteit te passen totdat het gewenste resultaat wordt verkregen. Opmerking: In de huidige studie, wordt de intensiteit van het licht dat door elke interferentie filter ingesteld tot een gelijke quantale uitgang te geven aan elk van de vier behandeling golfgebied. Het is belangrijk om de kalibratie regelmatig, zoals het lampvermogen wordt gewijzigd.
Opmerking: Na de set-up van het apparaat, de cellen zijn klaar om te worden verlicht Figuur 1 is een weergave van het licht levering apparaat gebruikt in de huidige studie..
Figuur 1. Beeld van het licht leveringapparaat. Illustrated zijn het licht energiebron, xenon lamp met behuizing, collimatielens, waterfilter, entree diafragma, vloeibare lichtgeleider, tweede collimatielens, filterhouder, behandeling frame en mat zwarte kaart. Merk op dat de smalbandige golflengte en intensiteit filters niet worden getoond.
2. Celbereiding
- De beschreven R / NIR-LT levering methode kan worden toegepast op elk type cel of in vitro modelsysteem; als zodanig de volgende beschrijvingen van celcultuur zijn algemeen, met behulp van gevestigde technieken om cultuur feochromocytoom (PC12), Müller (RMC1) en primaire gemengde retinale cellen.
- Voorafgaand aan de cel zaaien voor lichte behandeling en oxidatieve stress test, cultuur vereeuwigd cellen in hun respectieve groeimedia die geschikte supplementen (bijv., FBS, antibiotica) in T75 flasks tot 70-80% samenvloeiing.
- Maak geïmmortaliseerde cellen van T75 kolven, volgens de methode geschikt is voor het celtype te testen bv., Trypsine. Indien nodig, alvorens het zaaien van cellen in 96-well testplaten, laag putjes met 10 ug / ml poly-L-lysine gedurende 1 (bijv., Voor PC12 cellen) of 10 ug / ml poly-L-lysine voor 1u gevolgd door een O / N incubatie met 10 ug / ml laminine (bijv., voor gemengd retinale cellen).
- Centrifugeer cellen eventueel verzamelen (bijv., 3 min bij 405 xg gedurende PC12 cellen of 10 minuten bij 218 xg gedurende RMC1 cellen), verwijder het supernatant en resuspendeer in 8 ml passende celkweekmedium.
- Als gemengd retinale cellen worden gebruikt, te bereiden van P0-5 neonatale rat pups door enzymatische vertering (papaïne) volgens de vastgestelde procedures 19
- Tel het aantal levensvatbare cellen exclusief 0,4% (w / v) trypan blauw kleurstof met behulp van een hemocytometer.
- Pas celdichtheid such dat cellen ongeveer 70-80% samenvloeiing zal zijn na 24 of 48 uur in de cultuur. (Voor PC12 cellen het zaaien dichtheid 4,0 x 10 5 levensvatbare cellen / ml voor RMC1 cellen is 2,5 x 10 5 levensvatbare cellen / ml en gemengd retinale cellen is 8 x 10 5 levensvatbare cellen / ml). Na toevoeging cellen ofwel helder of zwarte 96-well platen (gebruikt voor de H 2 O 2 respectievelijk DCFH-DA-test) in 100 pl geschikte groeimedia, laat de plaat zitten op een vlakke ondergrond bij 37 ° C, 5 % CO2 (of alle omstandigheden geschikt zijn voor het specifieke celtype) gedurende ten minste 24 uur om celhechting mogelijk.
- Kweekcellen in groeimedia in de juiste 96 putjes schalen tot ze 70-80% confluent (24 voor PC12 en RMC1 cellen 48 voor gemengd retinale cellen).
3. Het toevoegen van glutamaat Stressor naar Cells
- Bereid L-glutaminezuur mononatrium zouthydraat stressor concentraties van 0-10mm in de juiste volledige kweekruimteste cultuur media.
- Verwijder het afdrukmateriaal uit de cellen en voorzichtig te wassen cellen 3 keer met PBS (PC12) of HBSS (RMC1 en gemengde retinale cellen). Na wassen, add-glutamaat bevattende media tot een totaal volume van 100 ul / putje.
4. Eerste Doseringen van Light Treatment
- Onmiddellijk na toevoeging van glutamaat of de stressor van keuze, cellen aan het licht behandeling in de gewenste golflengtes en intensiteiten bloot door het plaatsen van onder de voorbereide licht levering apparaat. Zorg ervoor dat u de quantale uitgang van de lichtbundel met behulp van de gevestigde combinaties van grijsfilters, afhankelijk van de golflengte wordt toegediend veranderen.
Opmerking: In de huidige experimenten cellen bloot aan lichtbehandeling gedurende 3 min werd de temperatuur te handhaven door te rusten met 96 putjes op een 37 ° C warmte pad. Behandeltijd kan naar behoefte worden gevarieerd.- Plaats een matte zwarte kaart onder de cellen aan het licht te voorkomen als gevolg van in de aangrenzende putten in de 96-well tray toegewezen aan andere behandelingsparameters.
- Als de behandeling wordt gewenst voor langere tijdsperioden, voeg 25 mM Hepes buffer pH van de celkweek media handhaven of idealiter plaats de inrichting en behandeling platen in een incubator met CO2-concentratie geregeld tot 5% CO2, of omstandigheden die optimaal zijn voor het specifieke celtype.
- Na voltooiing van de lichtbehandeling, plaatst de cellen op een vlakke ondergrond en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 (of alle omstandigheden optimaal zijn voor het celtype) gedurende 24 uur.
Opmerking: Extra doseringen van R / NIR-LT kan worden toegediend zoals hierboven beschreven, zoals gewenst.
5. Definitieve Dosering van Licht Behandeling en Detectie van ROS
- Voordat de laatste ronde van lichtbehandeling, bereid de reagentia te gebruiken voor ROS detectie. Bereid 50 mM citraatbuffer (pH 6,0), Triton X100 en H 2 O 2 detectiereagens werkenoplossing (1: 2: 97 verhouding van 10 mM H 2 O 2 detectiereagens voorraadoplossing, 10 U / ml mierikswortelperoxidase, 50 mM natriumcitraat (pH 6,0)). Bereid DCFH-DA in een eindconcentratie van 100 uM in geschikte media.
Opmerking: DCFH-DA reagens voor PC12 cellen in RPMI media, DCFH-DA reagens voor RMC1 cellen in DMEM media. Merk op dat commercieel verkrijgbaar detectie reagentia differentiële gevoeligheid voor bepaalde ROS en reagentia moeten zorgvuldig worden gekozen om de gewenste voor individuele toepassing informatie. - Dien lichtbehandeling aan de cellen, zoals beschreven in stap 4.1-4.1.2. Zorg ervoor dat de cellen worden behandeld met de gewenste invloeden / golflengten van het licht.
- Onmiddellijk na lichtbehandeling, verwijder de glutamaat-bevattende media en tweemaal wassen met geschikte buffer-oplossing (voor PC12 cellen, PBS wordt gebruikt en voor RMC1 cellen, wordt HBSS gebruikt). Voer de ROS assays op de cellen als volgt:
- H 2 O 2 CO2 gedurende 15 min. Voeg 50 ui H2O 2 detectie werkende oplossing en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Meet fluorescentie met een plaatlezer bij een excitatiegolflengte van 530 nm en een emissiegolflengte van 480 nm.
- DCF test: voeg 100 ul van 100 uM oplossing van DCFH-DA aan elk van de putjes en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en 5% CO2. Verwijder het medium dat 100 uM DCFH-DA en wassen met geschikte bufferoplossing (zoals hierboven beschreven) tweemaal. Voeg 90 pl bufferoplossing en 10 pl Triton X100 aan elk van de putten en schud op een orbitale schudder gedurende 30 seconden voor 15 min incubatie bij 37 ° C. Meet DCF afgeleid fluorescentie met behulp van een plaat reader met een excitatie golflengte van 480 nm en een emissie wavelength van 530nm.
- Express ROS waarden ten opzichte van de eiwitconcentratie van cellen die overblijven in de putjes met behulp van een colorimetrische kit om eiwitconcentratie kwantificeren volgens de instructies van de fabrikant met betrekking tot een standaardcurve mg proteïne berekenen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De lichtopbrengst afgegeven bij een golflengte van 670 nm werd gekalibreerd met grijsfilters om cellen te bestralen met verschillende invloeden omvat een dosis van 670 nm licht eerder gebleken bij vivo (0,3 J / cm2) 20 zijn. Aangezien het aantal grijsfilters voor de lichtbron vergroot, de intensiteit (W / m2) verlaagd, waardoor minder licht door te geven aan het doelgebied. Tabel 1 presenteert de kalibratiegegevens van 670 nm licht gegenereerd door de lichtbron voorzien van een golflengtefilter en omvat het aantal ND filters gebruikt en de lichtintensiteit geproduceerd doordat ten beschreven afstanden van de lichtopbrengst. Fluence of dosis van 670 nm licht (J / cm2) werd berekend uit de vergelijking: [Dosis (J / cm2) = (Lichtintensiteit (W / m2) / 10.000) x tijd (s)], waarbij de de tijd van de behandeling was 180s.
| Aantal ND filters | Afstand van lichtopbrengst (cm) | Intensiteit (W / m ^ 2) | Dosis (J / cm ^ 2) |
| 0 | 10.5 | 20.11 | 0.38 |
| 0 | 14 | 10.55 | 0.19 |
| 1 | 14 | 4.91 | 0.075 |
| 2 | 14 | 2.28 | 0,041 |
| 3 | 14 | 1.03 | 0,018 |
| 4 | 14 | 0.47 | 0,0085 |
| 5 | 14 | 0.21 | 0,0038 |
| 6 | 14 | 0,094 | 0,00169 |
| 7 | 14 | 0,045 | 0,00081 |
| 8 | 14 | 0.021 | 0.000378 |
| 9 | 14 | 0,013 | 0.000234 |
Tabel 1: Uitvoer van het licht leveringapparaat uitgerust met de 670nm golflengte filter .aantal ND filters verwijst naar het aantal grijsfilters gemonteerd op de voorzijde van de lichtbron output. Intensiteit (W / m2) verwijst naar de intensiteit van het licht zoals gerapporteerd door the fatsoen software. Fluence of dosis werd berekend door de vergelijking [dosis (J / cm2) = (Lichtintensiteit (W / m2) / 10.000) x tijd (s)], waarbij de blootstellingsduur was 180s en afstand tot de lichtopbrengst was 10,5 of 14 cm.
Twee klinisch relevante quantale invloeden van licht werden gekozen om differentiële effecten van R / NIR-LT golflengte op de productie van ROS te onderzoeken. Een dosis die CNS traktaten volgende transmissie door bovenliggende weefsel met behulp van LED-apparaten kunnen bereiken (dat wil zeggen, 1,78 W / m 2 bij 670 nm) 20 gelijkgesteld aan 0,03 J / cm 2 voor een 3 min behandeling, of 4,9 x 10 14 fotonen / cm2 / s. De lichtbron voorzien van filters die leiden tot emissie van 442, 550, 670 of 830 nm werd vervolgens gekalibreerd met combinaties van grijsfilters gelijke quantale uitgangen (fotonen) vormen voor elke golflengte in tegenstelling tot energie uitgangen (J / cm2), en de doseringen (J / cm 2) en intensities in W / m 2 berekend (tabel 2a). Een extra hogere dosis was op de aanbevolen richtlijnen cellulaire activiteit 21 werd gebruikt (1,29 x 10 15 fotonen / cm2 / s) en kalibratie uitgevoerd voor elke golflengte stimuleren (Tabel 2b).
| Golflengte (λ) | Dosis (J / cm ^ 2) | Intensiteit (W / m ^ 2) | Emissie (Fotonen / cm ^ 2 / s) |
| 442 | 0,057 | 3.21 | 4.8 x 10 ^ 14 |
| 550 | 0,051 | 2.87 | 5,0 x 10 ^ 14 |
| 670 | 0,032 | 1.78 | 4,9 x 10 ^ 14 |
| 830 | 0,018 | 1.01 | 4.9 x10 ^ 14 |
Tabel 2:. Kalibratie intensiteit van de dosering door gelijke aantallen fotonen geleverd op verschillende golflengten Intensiteit (W / m2), dosering gedurende 3 minuten behandeling (J / cm2) en emissie (fotonen / cm2 / s) wanneer uitgang van xenon lichtemitterende 442, 550, 670 en 830nm gekalibreerd uitstoten A) 4,9 x 10 14 fotonen / cm2 / s of B) 1,3 x 10 15 fotonen / cm2 / s op een afstand van 14 cm van de lichtopbrengst.
Om te beoordelen of het licht door het apparaat geleverd was toxisch voor cellen bij de doseringen gebruikt, onderzochten we het eiwitgehalte die nog in PC12 celcultuur putten na de ROS assays, met behulp van een colorimetrische eiwitassay. Er was geen significant verlies van eiwit in elk van de hogere productie doseringen van het licht (P> 0,05), wat aangeeft dat de dosis afgegeven licht niet werd veroorzaakt celdood (Figure 2) en is geschikt om te gebruiken voor de beoordeling van oxidatieve metabolisme.
Figuur 2: Effect van verschillende doseringen van licht op de totale eiwitconcentratie resterende kweekputjes volgende R / NIR-LT en ROS assay. Histogrambalken zijn het gemiddelde ± SEM eiwit concentraties in PC12 celcultuur putten, 6 herhalingen / concentratie, experimenten werden 3 keer herhaald. Er waren geen statistisch significante verschillen tussen de controle en één van de behandelingsgroepen zoals bepaald door analyse van variantie (ANOVA), p> 0.05.
We de effecten van 670nm licht leveren op invloeden variërend ,0085-0,38 J / cm2, als voorbeeld golflengte geschiktheid van het licht leveringapparaat beoordelen aanvankelijk geëvalueerd. Geen significante effect van 670 nm licht werd waargenomen bij elk van de geteste invloeden bij de beoordeling of H 2 O 2 of DCF fluorescentie in PC12, RMC1 of gemengde retinale cellen benadrukt met glutamaat (Figuur 3, P> 0,05). Ook waren er geen significante effecten van verschillende golflengten van R / NIR-LT geleverd op 4.9 x 10 14 fotonen / cm2 / s of 1,3 x 10 15 fotonen / cm2 / s op ROS productie bij de evaluatie H 2 O 2 of DCF fluorescentie (P> 0,05, gegevens niet getoond). De mogelijkheid om wijzigingen te detecteren in reactieve species wordt bevestigd door een toename in fluorescentie van de DCFH-DA reactieve kleurstof bij 13,44 ± 0,67 mM glutamaat 22.10 ± 2.10 in 10 mM glutamaat. Terwijl onze data niet positieve effecten van R / NIR-LT onthullen geleverd met behulp van ons licht leveringapparaat op ROS productie in de geselecteerde modelsysteem, noch waren er negatieve effecten als cellen niet werden aangetast, aangegeven door aanhoudende eiwitgehalte in de cultuurputten volgende lichttherapie (figuur 2). Als zodanig beschreven werkwijze een protocol voor het behandelen van cellen of mitochondria met een gedefinieerde dosis fotonen in een gebied van golflengten en kunnen worden gebruikt om hogere doseringen en andere meetinstrumenten, die optimalisering van R / NIR-LT parameters mogelijk beoordelen.
Figuur 3: Kwantificering van H 2 O 2 (AC) en DCF (DF) fluorescentie in PC12 (A, D), RMC1 (B, E) of gemengde retinale cellen (C, F) culturen in aanwezigheid van 10 mM glutamaat stressor, na 670nm bestraling therapie fluentie doseringen 0-0,38 J / cm2. Histogrambalken geven het gemiddelde arbitraire fluorescentie-eenheden / ug eiwit ± SEM. Er waren geen statistisch significantverschillen tussen controle en één van de behandelingsgroepen zoals bepaald door ANOVA, p> 0.05, 6 replicaten per groep werden experimenten 3 maal herhaald.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We hebben met succes aangepast nauwkeurig en gekalibreerd licht afgiftesysteem een mechanisme voor onderzoek optimalisering van R / NIR-LT in vitro. Golflengte en intensiteitswaarden van R / NIR-LT kunnen nauwkeurig en efficiënt worden gemanipuleerd met dit systeem. We stelden vast dat de lichtbehandeling van de cellen niet tot celdood, alhoewel ROS niet golflengten en doseringen geleverd verlaagd, in de celtypen getest. De maximale bereikt door het huidige systeem op 670nm (20.11W / m 2) intensiteiten zijn dan eerder gepubliceerde maatregelen van penetrantie van bestraling in de hersenen van de rat, waar 1,17 W / m 2 bereikte het ventrale oppervlak van de oogzenuw en 0.3W / m2 bereikt het ventrale oppervlak van de hersenpan. Wanneer gedurende 30 min geleverd door cellen van de optische zenuw in vivo ontvangen dosis derhalve 0,054-0,31 J / cm2. De doses van 670 nm licht geleverd in de huidige studie (tot 0.38J / cm2) derhalve omvatten die welke cellen in onze eerdere in vivo studies ontvingen.
De meest geaccepteerde theorie van R / NIR-LT werkzaamheid die van een photoacceptor systeem 18 Daarom is het noodzakelijk om te waarborgen dat cellen behandeld met verschillende golflengten gelijk worden quantale invloeden van licht (fotonen / cm2 / s) 8. Bovendien moet de belichtingstijd gebruikt om een bepaalde fluentie licht consistente tussen behandelingen worden gehouden, slechts de intensiteit van het licht verandert toenemen en totale energietoevoer tijd afnemen. Eerdere studies hebben aangetoond dat het veranderen van de belichtingstijd op gelijke invloeden resultaten te leveren in verschillen in uitkomstmaten en kunnen fungeren als een verstorende factor, en de identificatie van de optimale golflengte / Fluence parameters die nodig zijn voor een bepaald letsel model 22,23 belemmeren. Als zodanig, raden wij de zorgvuldige kalibratie van de doseringbij elke golflengte getest tot nuttige optimalisering van R / NIR-LT waarborgen.
De beschreven techniek maakt toediening van licht aan een reeks in vitro modelsystemen zoals organotypische slice cultures, wat kan resulteren in meer betekenisvolle resultaten vanwege het behoud van cellulaire architectuur en complexe intercellulaire interacties. Variaties op de schade-model kunnen verschillen in behandeling parameters van R / NIR-LT vereisen. Deze techniek wordt beperkt door het maximale vermogen bereikt met de beschreven instrumentatie. Hogere output vermogen kan worden vereist voor sommige in vitro en in vivo meeste toepassingen. Bij hogere vermogens licht vereist, kan de inrichting worden aangepast aan de intensiteit van licht dat de monsters te verhogen. Verkorten van de afstand tussen het licht beëindiging en doelcellen zal de intensiteit van het licht bereiken van de plaat te verhogen. Als alternatief kan het licht worden gereflecteerd door een spiegel en op de cellen als opposed om door middel van een vloeibare lichtgeleider wordt gefilterd, maar alternatieve golflengte en grijsfilters vereist zal zijn om dit te bereiken. Hogere uitgangen met een krachtige lichtbron ook vereist wanneer de methode werden aangepast voor afgifte van R / NIR-LT in in vivo modellen van CNS-verwonding, door de verhoogde doseringen die nodig zijn effectieve penetratie van bestraling 8,20 waarborgen .
Concluderend, de huidige studie beschrijft een nieuwe werkwijze van licht afgifte die een middel effectief veranderen intensiteit en golflengte parameters van licht in R / NIR-LT studies verschaft. Deze methodiek nuttig zullen zijn in optimalisatie van R / NIR-LT gebruik van een scala van uitkomstmaten en in vitro letsel modellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OxiSelect Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) | Cell Biolabs | STA-342 | |
| Amplex UltraRed Reagent | Molecular Probes | A36006 | |
| 300 Watt Xenon Arc Lamp | Newport Corporation | 6258 | Very intense light source, do not look directly into the lamp. Ensure there is sufficient cooling to the lamp whilst it is switched on |
| USB4000-FL Fluorescence Spectrometer | Ocean Optics | ||
| CC-3-UV Cosine Corrector for Emission Collection | Ocean Optics | ||
| 200μm diameter quartz fibre optic | Ocean Optics | ||
| SpectraSuite Spectroscopy Platform | Ocean Optics | ||
| 2300 EnSpire Multimode Plate Reader | Perkin Elmer | ||
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Acute toxicity, wear gloves when handling. |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | 142-47-2 (anhydrous) | |
| Pheochromocytoma rat adrenal medulla (PC12) cells | American Type Culture Collection | CRL-2522 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI1640) Media | Gibco | 11875-119 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Gibco | 10082-147 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Horse Serum, New Zealand origin | Gibco | 16050-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050-061 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-070 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140-050 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Retinal Muller (rMC1) cells | University of California, San Diego | ||
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965-118 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| 75 cm2 Flasks | BD Biosciences | B4-BE-353136 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | 25988-63-0 | Aliquot and store at -20 °C |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14025-134 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 10010-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Laminin Mouse Protein, Natural | Gibco | 23017-015 | Aliquot and store at -20 °C |
| 1X Neurobasal Medium | Gibco | 21103-049 | Warm to 37 °C in water bath before use |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250-061 | |
| 165U Papain | Worthington | ||
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | W326305 | |
| Corning 96 well plates, clear bottom, black | Corning | CLS3603-48EA | |
| Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates Untreated; Well shape: Round; Sterile. | Costar | 07-200-103 | |
| Seesaw Rocker | Standard lab epuipment | ||
| Centrifuge | Standard lab epuipment | ||
| Neutral Density Filter Paper (0.3) | THORLABS | ||
| 442 nm Bandpass Filter | THORLABS | FL441.6-10 | |
| 550 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB550-10 | |
| 670 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB670-10 | |
| 810 nm Bandpass Filter | THORLABS | FB810-10e | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.1) | THORLABS | NE01B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.2) | THORLABS | NE02B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.3) | THORLABS | NE03B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.5) | THORLABS | NE05B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (0.6) | THORLABS | NE06B | |
| Unmounted Ø25 mm Absorptive Neutral Density Filters (1.0) | THORLABS | NE10B |
References
- Gutterman, D. D. Mitochondria and reactive oxygen species an evolution in function. Circulation research. 97, 302-304 (2005).
- Camello-Almaraz, C., Gomez-Pinilla, P. J., Pozo, M. J., Camello, P. J. Mitochondrial reactive oxygen species and Ca2+ signaling. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 291, C1082-C1088 (2006).
- Kowaltowski, A. J., de Souza-Pinto, N. C., Castilho, R. F., Vercesi, A. E. Mitochondria and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 47, 333-343 (2009).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262, 689-695 (1993).
- Doble, A. The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy. Pharmacology & therapeutics. 81, 163-221 (1999).
- Hall, E. D. Antioxidant therapies for acute spinal cord injury. Neurotherapeutics. 8, 152-167 (2011).
- Jia, Z., et al. Oxidative stress in spinal cord injury and antioxidant-based intervention. Spinal Cord. 50, 264-274 (2012).
- Fitzgerald, M., et al. Red/near-infrared irradiation therapy for treatment of central nervous system injuries and disorders. Reviews in the Neurosciences. 24, 205-226 (2013).
- Rutar, M., Natoli, R., Albarracin, R., Valter, K., Provis, J. 670-nm light treatment reduces complement propagation following retinal degeneration. J Neuroinflammation. 9, 257 (2012).
- Eells, J. T., et al. Therapeutic photobiomodulation for methanol-induced retinal toxicity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 3439-3444 (2003).
- Begum, R., Powner, M. B., Hudson, N., Hogg, C., Jeffery, G. Treatment with 670 nm light up regulates cytochrome C oxidase expression and reduces inflammation in an age-related macular degeneration model. PloS one. 8, e57828 (2013).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers in surgery and medicine. 36, 171-185 (2005).
- Liang, H. L., et al. Photobiomodulation partially rescues visual cortical neurons from cyanide-induced apoptosis. Neuroscience. 139, 639-649 (2006).
- Zivin, J. A., et al. Effectiveness and safety of transcranial laser therapy for acute ischemic stroke. Stroke. 40, 1359-1364 (2009).
- Lapchak, P. A. Transcranial near-infrared laser therapy applied to promote clinical recovery in acute and chronic neurodegenerative diseases. Expert review of medical devices. 9, 71-83 (2012).
- Chung, H., et al. The nuts and bolts of low-level laser (light) therapy. Annals of biomedical engineering. 40, 516-533 (2012).
- Wu, Q., et al. Low-Level Laser Therapy for Closed-Head Traumatic Brain Injury in Mice: Effect of Different Wavelengths. Lasers in surgery and medicine. 44, 218-226 (2012).
- Hashmi, J. T., et al. Role of low-level laser therapy in neurorehabilitation. PM&R. 2, S292-S305 (2010).
- Fitzgerald, M., et al. Metallothionein-IIA promotes neurite growth via the megalin receptor. Experimental Brain Research. 183, 171-180 (2007).
- Fitzgerald, M., et al. Near infrared light reduces oxidative stress and preserves function in CNS tissue vulnerable to secondary degeneration following partial transection of the optic nerve. Journal of neurotrauma. 27, 2107-2119 (2010).
- Ando, T., et al. Low-level laser therapy for spinal cord injury in rats: effects of polarization. Journal of biomedical. 18, 098002 (2013).
- Lanzafame, R. J., et al. Reciprocity of exposure time and irradiance on energy density during photoradiation on wound healing in a murine pressure ulcer model. Lasers in surgery and medicine. 39, 534-542 (2007).
- Castano, A. P., et al. Low-level laser therapy for zymosan induced arthritis in rats: Importance of illumination time. Lasers in surgery and medicine. 39, 543-550 (2007).
